উদ্ভিদের মাইক্রোটিউবুলগুলিকে প্রভাবিত করে এমন নতুন উদ্ভিদ বৃদ্ধির বাধা হিসেবে উর্সা মনোঅ্যামাইডের আবিষ্কার, বৈশিষ্ট্য এবং কার্যকরী উন্নতি।

Nature.com দেখার জন্য আপনাকে ধন্যবাদ। আপনি যে ব্রাউজারটি ব্যবহার করছেন তার সংস্করণে সীমিত CSS সাপোর্ট রয়েছে। সেরা ফলাফলের জন্য, আমরা আপনাকে আপনার ব্রাউজারের একটি নতুন সংস্করণ ব্যবহার করার পরামর্শ দিচ্ছি (অথবা ইন্টারনেট এক্সপ্লোরারে সামঞ্জস্যতা মোড অক্ষম করুন)। ইতিমধ্যে, চলমান সহায়তা নিশ্চিত করার জন্য, আমরা স্টাইলিং বা জাভাস্ক্রিপ্ট ছাড়াই সাইটটি দেখাচ্ছি।
প্রাকৃতিক পণ্য আবিষ্কার এবং উপকারী ব্যবহার মানুষের জীবন উন্নত করতে সাহায্য করতে পারে। আগাছা নিয়ন্ত্রণের জন্য উদ্ভিদের বৃদ্ধি প্রতিরোধকারী রাসায়নিকগুলি ব্যাপকভাবে ভেষজনাশক হিসাবে ব্যবহৃত হয়। বিভিন্ন ধরণের ভেষজনাশক ব্যবহারের প্রয়োজনীয়তার কারণে, নতুন কর্মপদ্ধতি সহ যৌগগুলি সনাক্ত করার প্রয়োজন রয়েছে। এই গবেষণায়, আমরা স্ট্রেপ্টোমাইসিস ওয়ারেনসিস MK493-CF1 থেকে একটি নতুন N -alkoxypyrrole যৌগ, coumamonamide আবিষ্কার করেছি এবং সম্পূর্ণ সংশ্লেষণ প্রক্রিয়া প্রতিষ্ঠা করেছি। জৈবিক কার্যকলাপ পরীক্ষার মাধ্যমে, আমরা আবিষ্কার করেছি যে urs-monoamic অ্যাসিড হল urs-monoamide এর একটি সিন্থেটিক মধ্যবর্তী এবং একটি সম্ভাব্যউদ্ভিদ বৃদ্ধি প্রতিরোধক। এছাড়াও, আমরা বিভিন্ন urbenonic অ্যাসিড ডেরিভেটিভ তৈরি করেছি, যার মধ্যে urbenyloxy ডেরিভেটিভ (UDA) রয়েছে, যার উচ্চ ভেষজনাশক কার্যকলাপ রয়েছে এবং HeLa কোষের বৃদ্ধিকে নেতিবাচকভাবে প্রভাবিত করে না। আমরা আরও দেখেছি যে urmotonic অ্যাসিড ডেরিভেটিভগুলি উদ্ভিদের মাইক্রোটিউবুলগুলিকে ব্যাহত করে; উপরন্তু, KAND অ্যাক্টিন ফিলামেন্টগুলিকে প্রভাবিত করে এবং কোষের মৃত্যুকে প্ররোচিত করে; এই বহুমুখী প্রভাবগুলি পরিচিত মাইক্রোটিউবুল ইনহিবিটরগুলির থেকে পৃথক এবং ursonic অ্যাসিডের জন্য একটি নতুন কর্মপদ্ধতির পরামর্শ দেয়, যা নতুন ভেষজনাশক বিকাশে একটি গুরুত্বপূর্ণ সুবিধা উপস্থাপন করে।
উপকারী প্রাকৃতিক পণ্য এবং তাদের ডেরিভেটিভগুলির আবিষ্কার এবং ব্যবহারিক প্রয়োগ মানব জীবনের মান উন্নত করার একটি উপায়। অণুজীব, উদ্ভিদ এবং পোকামাকড় দ্বারা উৎপাদিত গৌণ বিপাকগুলি চিকিৎসা ও কৃষিতে ব্যাপক অগ্রগতি সাধন করেছে। প্রাকৃতিক পণ্য থেকে অনেক অ্যান্টিবায়োটিক এবং লিউকেমিয়া প্রতিরোধী ওষুধ তৈরি করা হয়েছে। এছাড়াও, বিভিন্ন ধরণেরকীটনাশক, ছত্রাকনাশক এবং ভেষজনাশক কৃষিতে ব্যবহারের জন্য এই প্রাকৃতিক পণ্যগুলি থেকে নিষ্কাশিত হয়। বিশেষ করে, আধুনিক কৃষিতে ফসলের ফলন বৃদ্ধির জন্য আগাছা নিয়ন্ত্রণ ভেষজনাশক গুরুত্বপূর্ণ হাতিয়ার এবং বিভিন্ন ধরণের যৌগ ইতিমধ্যেই বাণিজ্যিকভাবে ব্যবহৃত হচ্ছে। উদ্ভিদের বেশ কয়েকটি কোষীয় প্রক্রিয়া, যেমন সালোকসংশ্লেষণ, অ্যামিনো অ্যাসিড বিপাক, কোষ প্রাচীর সংশ্লেষণ, মাইটোসিস নিয়ন্ত্রণ, ফাইটোহরমোন সংকেত, বা প্রোটিন সংশ্লেষণ, ভেষজনাশকের সাধারণ লক্ষ্য হিসাবে বিবেচিত হয়। মাইক্রোটিউবুলের কার্যকারিতা বাধাগ্রস্ত করে এমন যৌগগুলি ভেষজনাশকের একটি সাধারণ শ্রেণী যা মাইটোটিক নিয়ন্ত্রণকে প্রভাবিত করে উদ্ভিদের বৃদ্ধিকে প্রভাবিত করে।
মাইক্রোটিউবুলগুলি সাইটোস্কেলিটনের উপাদান এবং ইউক্যারিওটিক কোষে ব্যাপকভাবে সংরক্ষিত থাকে। টিউবুলিন হেটেরোডাইমারে α-টিউবুলিন এবং β-টিউবুলিন থাকে যা রৈখিক মাইক্রোটিউবুল প্রোটোফিলামেন্ট তৈরি করে, যার মধ্যে 13টি প্রোটোফিলামেন্ট একটি নলাকার কাঠামো তৈরি করে। মাইক্রোটিউবুলগুলি উদ্ভিদ কোষে একাধিক ভূমিকা পালন করে, যার মধ্যে রয়েছে কোষের আকৃতি নির্ধারণ, কোষ বিভাজন এবং অন্তঃকোষীয় পরিবহন 3,4। উদ্ভিদ কোষগুলিতে ইন্টারফেজ প্লাজমা ঝিল্লির নীচে মাইক্রোটিউবুল থাকে এবং এই তথাকথিত কর্টিকাল মাইক্রোটিউবুলগুলি সেলুলোজ সিন্থেস কমপ্লেক্স নিয়ন্ত্রণের মাধ্যমে সেলুলোজ মাইক্রোফাইব্রিলের সংগঠন নিয়ন্ত্রণ করে বলে মনে করা হয় 4,5। মূল এপিডার্মাল কোষের কর্টিকাল মাইক্রোটিউবুলগুলি, মূল অগ্রভাগের দ্রুত প্রসারণের অঞ্চলে উপস্থিত, পার্শ্বীয়ভাবে অবস্থিত, এবং সেলুলোজ মাইক্রোফাইবারগুলি এই মাইক্রোটিউবুলগুলি অনুসরণ করে এবং কোষের প্রসারণের দিক সীমিত করে, যার ফলে অ্যানিসোট্রপিক কোষের প্রসারণ বৃদ্ধি পায়। অতএব, মাইক্রোটিউবুলের কার্যকারিতা উদ্ভিদের আকারবিদ্যার সাথে ঘনিষ্ঠভাবে সম্পর্কিত। টিউবুলিন এনকোডিং জিনে অ্যামিনো অ্যাসিড প্রতিস্থাপনের ফলে কর্টিকাল মাইক্রোটিউবুল অ্যারেগুলির বিকৃতি ঘটে এবং অ্যারাবিডোপসিস 6,7-এ বাম বা ডান দিকের বৃদ্ধি ঘটে। একইভাবে, মাইক্রোটিউবুল-সম্পর্কিত প্রোটিনের মিউটেশন যা মাইক্রোটিউবুলের গতিবিদ্যা নিয়ন্ত্রণ করে তাও বিকৃত মূল বৃদ্ধির দিকে পরিচালিত করতে পারে8,9,10,11,12,13। এছাড়াও, ডিসোপাইরামাইড, যা প্রিটিলাক্লোর নামেও পরিচিত, এর মতো মাইক্রোটিউবুল-বিঘ্নিত হার্বিসাইড দিয়ে চিকিত্সাও বাম দিকের তির্যক মূল বৃদ্ধির কারণ হয়14। এই তথ্যগুলি নির্দেশ করে যে উদ্ভিদের বৃদ্ধির দিক নির্ধারণের জন্য মাইক্রোটিউবুলের কার্যকারিতার সুনির্দিষ্ট নিয়ন্ত্রণ অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ।
বিভিন্ন ধরণের মাইক্রোটিউবুল ইনহিবিটর আবিষ্কৃত হয়েছে, এবং এই ওষুধগুলি সাইটোস্কেলিটাল গবেষণার পাশাপাশি কৃষি ও চিকিৎসা ক্ষেত্রেও গুরুত্বপূর্ণ অবদান রেখেছে। বিশেষ করে, ওরিজালিন, ডাইনাইট্রোঅ্যানিলিন যৌগ, ডিসোপাইরামাইড, বেনজামাইড-সম্পর্কিত যৌগ এবং তাদের অ্যানালগগুলি মাইক্রোটিউবুলের কার্যকারিতা বাধাগ্রস্ত করতে পারে এবং এর ফলে উদ্ভিদের বৃদ্ধি বাধাগ্রস্ত করতে পারে। অতএব, এগুলি ব্যাপকভাবে ভেষজনাশক হিসাবে ব্যবহৃত হয়। যাইহোক, যেহেতু মাইক্রোটিউবুলগুলি উদ্ভিদ এবং প্রাণী কোষের একটি গুরুত্বপূর্ণ উপাদান, তাই বেশিরভাগ মাইক্রোটিউবুল ইনহিবিটর উভয় ধরণের কোষের জন্যই সাইটোটক্সিক। অতএব, ভেষজনাশক হিসাবে তাদের স্বীকৃত উপযোগিতা সত্ত্বেও, ব্যবহারিক উদ্দেশ্যে সীমিত সংখ্যক অ্যান্টিমাইক্রোটিউবুল এজেন্ট ব্যবহার করা হয়।
স্ট্রেপ্টোমাইসিস হল স্ট্রেপ্টোমাইসিস পরিবারের একটি প্রজাতি, যার মধ্যে অ্যারোবিক, গ্রাম-পজিটিভ, ফিলামেন্টাস ব্যাকটেরিয়া রয়েছে এবং এটি বিস্তৃত পরিসরের গৌণ বিপাক তৈরির ক্ষমতার জন্য ব্যাপকভাবে পরিচিত। অতএব, এটিকে নতুন জৈবিকভাবে সক্রিয় প্রাকৃতিক পণ্যগুলির অন্যতম গুরুত্বপূর্ণ উৎস হিসেবে বিবেচনা করা হয়। বর্তমান গবেষণায়, আমরা coumamonamide নামে একটি নতুন যৌগ আবিষ্কার করেছি, যা Streptomyces werraensis MK493-CF1 এবং S. werraensis ISP 5486 থেকে বিচ্ছিন্ন ছিল। বর্ণালী বিশ্লেষণ এবং সম্পূর্ণ বর্ণালী বিশ্লেষণ ব্যবহার করে, coumamonamide এর গঠন চিহ্নিত করা হয়েছিল এবং এর অনন্য N-alkoxypyrrole কঙ্কালের সংশ্লেষণ নির্ধারণ করা হয়েছিল। সংশ্লেষণ। ursmonoamide এবং এর ডেরিভেটিভগুলির একটি সিন্থেটিক ইন্টারমিডিয়েট, Ursmonic অ্যাসিড, জনপ্রিয় মডেল উদ্ভিদ Arabidopsis thaliana এর বৃদ্ধি এবং অঙ্কুরোদগমকে বাধাগ্রস্ত করতে দেখা গেছে। একটি কাঠামো-কার্যকলাপ সম্পর্ক গবেষণায়, আমরা দেখতে পেয়েছি যে C9 সহ একটি যৌগ যা ursonic অ্যাসিডে পরিবর্তিত হয়েছে, যাকে ursonic অ্যাসিডের nonyloxy ডেরিভেটিভ (KAND) বলা হয়, বৃদ্ধি এবং অঙ্কুরোদগমের উপর বাধা প্রভাবকে উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি করে। উল্লেখযোগ্যভাবে, নতুন আবিষ্কৃত উদ্ভিদ বৃদ্ধি প্রতিরোধক তামাক এবং লিভারওয়ার্টের বৃদ্ধিকেও প্রভাবিত করেছিল এবং ব্যাকটেরিয়া বা HeLa কোষের জন্য সাইটোটক্সিক ছিল না। তাছাড়া, কিছু উরমোটোনিক অ্যাসিড ডেরিভেটিভ একটি বিকৃত মূল ফেনোটাইপ তৈরি করে, যার অর্থ এই ডেরিভেটিভগুলি প্রত্যক্ষ বা পরোক্ষভাবে মাইক্রোটিউবুলগুলিকে প্রভাবিত করে। এই ধারণার সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, ইমিউনোহিস্টোকেমিক্যালি বা ফ্লুরোসেন্ট প্রোটিন দিয়ে লেবেলযুক্ত মাইক্রোটিউবুলগুলির আমাদের পর্যবেক্ষণগুলি ইঙ্গিত দেয় যে KAND চিকিত্সা মাইক্রোটিউবুলগুলিকে ডিপলিমারাইজ করে। এছাড়াও, কুমামোটোনিক অ্যাসিড ডেরিভেটিভগুলির সাথে চিকিত্সা অ্যাক্টিন মাইক্রোফিলামেন্টগুলিকে ব্যাহত করে। সুতরাং, আমরা একটি নতুন উদ্ভিদ বৃদ্ধি প্রতিরোধক আবিষ্কার করেছি যার ক্রিয়াকলাপের অনন্য প্রক্রিয়া সাইটোস্কেলটন ধ্বংস করে।
টোকিওর শিনাগাওয়া-কুতে মাটি থেকে MK493-CF1 স্ট্রেন বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল। স্ট্রেন MK493-CF1 সু-শাখাযুক্ত স্ট্রোমাল মাইসেলিয়াম গঠন করেছিল। 16S রাইবোসোমাল RNA জিনের আংশিক ক্রম (1422 bp) নির্ধারণ করা হয়েছিল। এই স্ট্রেনটি S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: সাধারণ স্ট্রেন, 99.93%) এর সাথে খুব মিল। এই ফলাফলের উপর ভিত্তি করে, এটি নির্ধারণ করা হয়েছিল যে এই স্ট্রেনটি S. werraensis-এর ধরণের স্ট্রেনের সাথে ঘনিষ্ঠভাবে সম্পর্কিত। অতএব, আমরা অস্থায়ীভাবে এই স্ট্রেনটির নামকরণ করেছি S. werraensis MK493-CF1। S. werraensis ISP 5486Tও একই জৈব-সক্রিয় যৌগ তৈরি করে। যেহেতু এই অণুজীব থেকে প্রাকৃতিক পণ্য প্রাপ্তির বিষয়ে প্রাথমিক গবেষণা খুব কম ছিল, তাই আরও রাসায়নিক গবেষণা করা হয়েছিল। ৩০°C তাপমাত্রায় কঠিন অবস্থায় গাঁজন করে বার্লি মাধ্যমে S. werraensis MK493-CF1 চাষ করার পর, ৫০% EtOH দিয়ে মাধ্যমটি বের করা হয়। ৫৯.৫ মিলিগ্রাম অপরিশোধিত নির্যাস পেতে ৬০ মিলি নমুনা শুকানো হয়। অপরিশোধিত নির্যাসটিকে বিপরীত পর্যায়ের HPLC দেওয়া হয় যাতে N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (১, নাম coumamonamide, ৩৬.০ মিলিগ্রাম) পাওয়া যায়। ১ এর মোট পরিমাণ অপরিশোধিত নির্যাসের প্রায় ৬০%। অতএব, আমরা কুমামোটোঅ্যামাইড ১ এর বৈশিষ্ট্যগুলি বিস্তারিতভাবে অধ্যয়ন করার সিদ্ধান্ত নিয়েছি।
Coumamonamide 1 হল একটি সাদা অ্যামোরফাস পাউডার এবং উচ্চ রেজোলিউশন ভর স্পেকট্রোমেট্রি (HRESIMS) C6H8N2O2 নিশ্চিত করে (চিত্র 1)। এই যৌগের C2-প্রতিস্থাপিত পাইরোল খণ্ডটি δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH 1H NMR বর্ণালীতে: 4.5 Hz, H-5) এবং δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6) দ্বারা চিহ্নিত করা হয়েছে, এবং 13C NMR বর্ণালী চারটি sp2 কার্বন পরমাণুর উপস্থিতি দেখায়। C2 অবস্থানে একটি অ্যামাইড গ্রুপের উপস্থিতি δC 161.1 এ C-3 প্রোটন থেকে অ্যামাইড কার্বনিল কার্বনের সাথে HMBC পারস্পরিক সম্পর্ক দ্বারা মূল্যায়ন করা হয়েছিল। এছাড়াও, δH 4.10 (3H, S) এবং δC 68.3 এ 1 H এবং 13 C NMR শীর্ষ অণুতে N-মিথোক্সি গ্রুপের উপস্থিতি নির্দেশ করে। যদিও বর্ধিত পার্থক্য বর্ণালী এবং নিউক্লিয়ার ওভারহাউজার সংক্ষেপণ (NOEDF) এর মতো বর্ণালী বিশ্লেষণ ব্যবহার করে মিথোক্সি গ্রুপের সঠিক অবস্থান এখনও নির্ধারণ করা হয়নি, N-মিথোক্সি-1H-পাইরোল-2-কারবক্সামাইড প্রথম প্রার্থী যৌগ হয়ে ওঠে।
১-এর সঠিক গঠন নির্ধারণের জন্য, একটি সম্পূর্ণ সংশ্লেষণ করা হয়েছিল (চিত্র ২ক)। বাণিজ্যিকভাবে উপলব্ধ ২-অ্যামিনোপাইরিডিন ২-এর m-CPBA দিয়ে চিকিৎসার ফলে পরিমাণগত ফলনে N-অক্সাইড ৩ পাওয়া যায়। ২-এর ২-অ্যামিনোজিডেশনের পর, আব্রামোভিচ কর্তৃক বর্ণিত সাইক্লোকন্ডেনসেশন বিক্রিয়াটি ৯০°C তাপমাত্রায় বেনজিনে করা হয়েছিল যাতে কাঙ্ক্ষিত ১-হাইড্রোক্সি-১এইচ-পাইরোল-২-কার্বোনিট্রাইল ৫ গ্রামে পাওয়া যায়। গতি ৬০% (দুটি ধাপ)। ১৫,১৬। ৪-এর মিথাইলেশন এবং হাইড্রোলাইসিসের ফলে ১-মিথোক্সি-১এইচ-পাইরোল-২-কার্বোঅক্সিলিক অ্যাসিড (যাকে "কিউমোটোনিক অ্যাসিড" বলা হয়, ৬) ভালো ফলনে (৭০%, দুটি ধাপ) পাওয়া যায়। অবশেষে, জলীয় অ্যামোনিয়া ব্যবহার করে অ্যাসিড ক্লোরাইড ইন্টারমিডিয়েট ৬-এর মাধ্যমে অ্যামিডেশনের ফলে ৯৮% ফলনে কুমামোটো অ্যামাইড ১ পাওয়া যায়। সংশ্লেষিত ১-এর সমস্ত বর্ণালী তথ্য বিচ্ছিন্ন ১-এর অনুরূপ ছিল, তাই ১-এর গঠন নির্ধারণ করা হয়েছিল;
আরবেনামাইড এবং আরবেনিক অ্যাসিডের জৈবিক ক্রিয়াকলাপের সাধারণ সংশ্লেষণ এবং বিশ্লেষণ। (ক) কুমামোটো অ্যামাইডের মোট সংশ্লেষণ। (খ) সাত দিন বয়সী বন্য ধরণের অ্যারাবিডোপসিস কলম্বিয়া (কোল) চারাগুলি নির্দেশিত ঘনত্বে কুমামোনামাইড 6 বা কুমামোনামাইড 1 ধারণকারী মুরাশিগে এবং স্কুগ (এমএস) প্লেটে জন্মানো হয়েছিল। স্কেল বার = 1 সেমি।
প্রথমে, আমরা উদ্ভিদের বৃদ্ধি নিয়ন্ত্রণ করার ক্ষমতার জন্য urbenamide এবং এর মধ্যস্থ পদার্থের জৈবিক কার্যকলাপ মূল্যায়ন করেছি। আমরা MS agar মাধ্যমের সাথে ursmonamide 1 বা ursmonic acid 6 এর বিভিন্ন ঘনত্ব যোগ করেছি এবং এই মাধ্যমের উপর Arabidopsis thaliana চারা চাষ করেছি। এই পরীক্ষাগুলি দেখিয়েছে যে 6 এর উচ্চ ঘনত্ব (500 μM) মূল বৃদ্ধিকে বাধা দেয় (চিত্র 2b)। এরপর, আমরা 6 এর N1 অবস্থান প্রতিস্থাপন করে বিভিন্ন ডেরিভেটিভ তৈরি করেছি এবং তাদের উপর কাঠামো-কার্যকলাপ সম্পর্ক অধ্যয়ন করেছি (অ্যানালগ সংশ্লেষণ প্রক্রিয়াটি সহায়ক তথ্য (SI) তে বর্ণিত হয়েছে)। Arabidopsis চারাগুলি 50 μM ursonic অ্যাসিড ডেরিভেটিভ ধারণকারী একটি মাধ্যমে জন্মানো হয়েছিল, এবং মূলের দৈর্ঘ্য পরিমাপ করা হয়েছিল। যেমনটি ছবিতে দেখানো হয়েছে। চিত্র 3a, b, এবং S1-এ দেখানো হয়েছে, কুমামো অ্যাসিডের N1 অবস্থানে রৈখিক অ্যালকোক্সি শৃঙ্খল (9, 10, 11, 12, এবং 13) বা বৃহৎ অ্যালকোক্সি শৃঙ্খল (15, 16, এবং 17) বিভিন্ন দৈর্ঘ্যের হয়। ডেরিভেটিভগুলি মূল বৃদ্ধিতে উল্লেখযোগ্য বাধা দেখিয়েছে। উপরন্তু, আমরা দেখতে পেয়েছি যে 200 μM 10, 11, বা 17 প্রয়োগ অঙ্কুরোদগমকে বাধা দেয় (চিত্র 3c এবং S2)।
কুমামোটো অ্যামাইড এবং সংশ্লিষ্ট যৌগগুলির গঠন-কার্যকলাপ সম্পর্কের অধ্যয়ন। (ক) অ্যানালগগুলির গঠন এবং সংশ্লেষণ পরিকল্পনা। (খ) 50 μM কুমামোনামাইড ডেরিভেটিভ সহ বা ছাড়াই MS মাধ্যমে জন্মানো 7 দিন বয়সী চারাগুলির মূল দৈর্ঘ্যের পরিমাণ নির্ধারণ। নকল চিকিৎসার সাথে তারকাচিহ্নগুলি উল্লেখযোগ্য পার্থক্য নির্দেশ করে (t পরীক্ষা, p< ০.০৫). n>১৮. তথ্যগুলি গড় ± SD হিসাবে দেখানো হয়েছে। nt এর অর্থ "পরীক্ষিত নয়" কারণ ৫০% এরও বেশি বীজ অঙ্কুরিত হয়নি। (গ) ২০০ μM কুমামোনামাইড এবং সম্পর্কিত যৌগ সহ বা ছাড়াই MS মাধ্যমে ৭ দিন ধরে ইনকিউবেটেড প্রক্রিয়াজাত বীজের অঙ্কুরোদগমের হারের পরিমাণ নির্ধারণ। তারকাচিহ্নগুলি নকল চিকিত্সার (চি-স্কোয়ার পরীক্ষা) সাথে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য নির্দেশ করে। n=৯৬।
মজার বিষয় হল, C9 এর চেয়ে দীর্ঘ অ্যালকাইল পার্শ্ব শৃঙ্খল যোগ করার ফলে বাধামূলক কার্যকলাপ হ্রাস পেয়েছে, যা পরামর্শ দেয় যে কুমামোটোইক অ্যাসিড-সম্পর্কিত যৌগগুলির জৈবিক কার্যকলাপ প্রদর্শনের জন্য একটি নির্দিষ্ট আকারের পার্শ্ব শৃঙ্খলের প্রয়োজন হয়।
যেহেতু গঠন-কার্যকলাপ সম্পর্ক বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে C9 কে উরসোনিক অ্যাসিডে রূপান্তরিত করা হয়েছিল এবং উরসোনিক অ্যাসিডের নন-ইলক্সি ডেরিভেটিভ (এরপর থেকে KAND 11 হিসাবে উল্লেখ করা হয়েছে) সবচেয়ে কার্যকর উদ্ভিদ বৃদ্ধি প্রতিরোধক ছিল, আমরা KAND 11 এর আরও বিশদ বৈশিষ্ট্য পরিচালনা করেছি। 50 μM KAND 11 দিয়ে অ্যারাবিডোপসিসের চিকিত্সা প্রায় সম্পূর্ণরূপে অঙ্কুরোদগমকে বাধা দেয়, যেখানে KAND 11 এর কম ঘনত্ব (40, 30, 20, বা 10 μM) ডোজ-নির্ভর পদ্ধতিতে মূল বৃদ্ধিকে বাধা দেয় (চিত্র 4a, b)। KAND 11 মূল মেরিস্টেমের কার্যকারিতাকে প্রভাবিত করে কিনা তা পরীক্ষা করার জন্য, আমরা প্রোপিডিয়াম আয়োডাইড (PI) দিয়ে দাগযুক্ত মূল মেরিস্টেম পরীক্ষা করেছি এবং মেরিস্টেমের ক্ষেত্রের আকার পরিমাপ করেছি। ২৫ μM KAND-11 ধারণকারী মাধ্যমে জন্মানো চারাগাছের মেরিস্টেমের আকার ছিল ১৫১.১ ± ৩২.৫ μm, যেখানে DMSO ধারণকারী নিয়ন্ত্রণ মাধ্যমে জন্মানো চারাগাছের মেরিস্টেমের আকার ছিল ২৬৪.৭ ± ​​৩০.৮ μm (চিত্র ৪c, d), যা নির্দেশ করে যে KAND-11 কোষীয় কার্যকলাপ পুনরুদ্ধার করে। বিস্তার। মূল মেরিস্টেম। এর সাথে সামঞ্জস্য রেখে, KAND ১১ চিকিৎসা মূল মেরিস্টেমে কোষ বিভাজন চিহ্নিতকারী CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS সংকেতের পরিমাণ হ্রাস করেছে (চিত্র ৪e) ১৭। এই ফলাফলগুলি নির্দেশ করে যে KAND ১১ কোষের বিস্তার কার্যকলাপ হ্রাস করে মূল বৃদ্ধিকে বাধা দেয়।
বৃদ্ধির উপর আরবেনোনিক অ্যাসিড ডেরিভেটিভস (আরবেনাইলক্সি ডেরিভেটিভস) এর প্রতিরোধমূলক প্রভাব বিশ্লেষণ। (ক) KAND 11 এর নির্দেশিত ঘনত্ব সহ MS প্লেটে জন্মানো 7 দিন বয়সী বন্য-প্রকারের কোল চারা। স্কেল বার = 1 সেমি। (খ) মূলের দৈর্ঘ্যের পরিমাণ নির্ধারণ। অক্ষরগুলি উল্লেখযোগ্য পার্থক্য নির্দেশ করে (টুকি এইচএসডি পরীক্ষা, পৃ.< ০.০৫). n>১৬. তথ্য গড় ± SD হিসেবে দেখানো হয়েছে। (c) ২৫ μM KAND সহ বা ছাড়া MS প্লেটে জন্মানো প্রোপিডিয়াম আয়োডাইড-দাগযুক্ত বন্য-প্রকারের কোল শিকড়ের কনফোকাল মাইক্রোস্কোপি ১১. সাদা বন্ধনী মূল মেরিস্টেম নির্দেশ করে। স্কেল বার = ১০০ µm। (d) মূল মেরিস্টেমের আকারের পরিমাণ নির্ধারণ (n = ১০ থেকে ১১)। পরিসংখ্যানগত পার্থক্যগুলি t-পরীক্ষা (p) ব্যবহার করে নির্ধারণ করা হয়েছিল।< ০.০৫)। বারগুলি গড় মেরিস্টেম আকারের প্রতিনিধিত্ব করে। (ঙ) CDKB2 গঠন ধারণকারী একটি মূল মেরিস্টেমের ডিফারেনশিয়াল ইন্টারফেরেন্স কনট্রাস্ট (DIC) মাইক্রোস্কোপি; 1pro: CDKB2; 25 µM KAND অ্যাস সহ বা ছাড়াই MS প্লেটে জন্মানো 5-দিন বয়সী চারাগুলিতে 1-GUS দাগযুক্ত এবং দাগযুক্ত।
KAND 11 এর ফাইটোটক্সিসিটি আরও পরীক্ষা করা হয়েছিল আরেকটি দ্বিবীজপত্রী উদ্ভিদ, তামাক (Nicotiana tabacum) এবং একটি প্রধান ভূমি উদ্ভিদ মডেল জীব, লিভারওয়ার্ট (Marchantia polymorpha) ব্যবহার করে। Arabidopsis-এর মতো, 25 μM KAND 11 ধারণকারী মাধ্যমে জন্মানো তামাক SR-1 চারা ছোট শিকড় তৈরি করে (চিত্র 5a)। অতিরিক্তভাবে, 48টি বীজের মধ্যে 40টি 200 μM KAND 11 ধারণকারী প্লেটে অঙ্কুরিত হয়েছিল, যেখানে 48টি বীজই নকল-চিকিৎসা করা মাধ্যমে অঙ্কুরিত হয়েছিল, যা নির্দেশ করে যে KAND-এর উচ্চ ঘনত্ব উল্লেখযোগ্য ছিল (p< 0.05; chi test -square) তামাকের অঙ্কুরোদগমকে বাধা দেয়। (চিত্র 5b)। এছাড়াও, লিভারওয়ার্টে ব্যাকটেরিয়ার বৃদ্ধিকে বাধা দেয় এমন KAND 11 এর ঘনত্ব অ্যারাবিডোপসিসের কার্যকর ঘনত্বের (চিত্র 5c) অনুরূপ। এই ফলাফলগুলি ইঙ্গিত দেয় যে KAND 11 বিভিন্ন ধরণের উদ্ভিদের বৃদ্ধিকে বাধা দিতে পারে। এরপর আমরা উচ্চতর প্রাণী এবং ব্যাকটেরিয়া কোষের প্রতিনিধি হিসাবে যথাক্রমে অন্যান্য জীবের, যেমন মানব HeLa কোষ এবং Escherichia coli স্ট্রেন DH5α-তে ভালুক মনোঅ্যামাইড-সম্পর্কিত যৌগগুলির সম্ভাব্য সাইটোটক্সিসিটি তদন্ত করেছি। কোষ বিস্তার পরীক্ষাগুলির একটি সিরিজে, আমরা লক্ষ্য করেছি যে 100 μM ঘনত্বে coumamonamide 1, coumamonamidic অ্যাসিড 6, এবং KAND 11 HeLa বা E. coli কোষের বৃদ্ধিকে প্রভাবিত করেনি (চিত্র 5d,e)।
অ-আরবিডোপসিস জীবের ক্ষেত্রে KAND 11 এর বৃদ্ধি বাধা। (a) দুই সপ্তাহ বয়সী বন্য-প্রকার SR-1 তামাকের চারা উল্লম্বভাবে অবস্থিত MS প্লেটে জন্মানো হয়েছিল যার মধ্যে 25 μM KAND 11 ছিল। (b) দুই সপ্তাহ বয়সী বন্য-প্রকার SR-1 তামাকের চারা অনুভূমিকভাবে অবস্থিত MS প্লেটে জন্মানো হয়েছিল যার মধ্যে 200 μM KAND 11 ছিল। (c) দুই সপ্তাহ বয়সী বন্য-প্রকার Tak-1 লিভারওয়ার্ট কুঁড়ি যা Gamborg B5 প্লেটে জন্মেছিল যার ঘনত্ব KAND 11 এর নির্দেশিত। লাল তীরগুলি নির্দেশ করে যে স্পোরগুলি দুই সপ্তাহের ইনকিউবেশন সময়ের মধ্যে বৃদ্ধি বন্ধ করে দিয়েছে। (d) HeLa কোষের কোষ বিস্তার পরীক্ষা। কোষ গণনা কিট 8 (Dojindo) ব্যবহার করে নির্দিষ্ট সময়ের ব্যবধানে কার্যকর কোষের সংখ্যা পরিমাপ করা হয়েছিল। নিয়ন্ত্রণ হিসাবে, HeLa কোষগুলিকে 5 μg/ml অ্যাক্টিনোমাইসিন D (Act D) দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল, যা RNA পলিমারেজ ট্রান্সক্রিপশনকে বাধা দেয় এবং কোষের মৃত্যু ঘটায়। বিশ্লেষণগুলি তিনটি প্রতিলিপিতে করা হয়েছিল। (e) E. coli কোষ বিস্তার পরীক্ষা। OD600 পরিমাপ করে E. coli বৃদ্ধি বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। নিয়ন্ত্রণ হিসাবে, কোষগুলিকে 50 μg/ml অ্যাম্পিসিলিন (Amp) দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল, যা ব্যাকটেরিয়ার কোষ প্রাচীর সংশ্লেষণকে বাধা দেয়। বিশ্লেষণগুলি তিনটি প্রতিলিপিতে করা হয়েছিল।
ইউরামাইড-সম্পর্কিত যৌগগুলির কারণে সৃষ্ট সাইটোটক্সিসিটির ক্রিয়া প্রক্রিয়াটি বোঝার জন্য, আমরা মাঝারি প্রতিরোধমূলক প্রভাব সহ আরবেনিক অ্যাসিড ডেরিভেটিভগুলি পুনরায় বিশ্লেষণ করেছি। যেমনটি ছবিতে দেখানো হয়েছে। চিত্র 2b, 6a-তে দেখানো হয়েছে, উচ্চ ঘনত্বের (200 μM) উরমোটোনিক অ্যাসিড 6 ধারণকারী আগর প্লেটে জন্মানো চারাগুলি ছোট এবং বাম-বাঁকা শিকড় তৈরি করেছিল (θ = – 23.7 ± 6.1), যেখানে নিয়ন্ত্রণ মাধ্যমে জন্মানো চারাগুলি প্রায় সোজা শিকড় তৈরি করেছিল (θ = – 3.8 ± 7.1)। এই বৈশিষ্ট্যযুক্ত তির্যক বৃদ্ধি কর্টিকাল মাইক্রোটিউবুলের কর্মহীনতার ফলে ঘটে বলে জানা যায়14,18। এই আবিষ্কারের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, মাইক্রোটিউবুল-অস্থিরকারী ওষুধ ডিসোপাইরামাইড এবং অরিজালিন আমাদের বৃদ্ধির পরিস্থিতিতে একই রকম মূল কাত করে (চিত্র 2b, 6a)। একই সময়ে, আমরা উরমোটোনিক অ্যাসিড ডেরিভেটিভগুলি পরীক্ষা করেছি এবং তাদের মধ্যে বেশ কয়েকটি নির্বাচন করেছি যা নির্দিষ্ট ঘনত্বে, তির্যক শিকড়ের বৃদ্ধিকে প্ররোচিত করে। যৌগ ৮, ৯ এবং ১৫ যথাক্রমে ৭৫ μM, ৫০ μM এবং ৪০ μM এ মূল বৃদ্ধির দিক পরিবর্তন করেছে, যা ইঙ্গিত করে যে এই যৌগগুলি কার্যকরভাবে মাইক্রোটিউবুলগুলিকে অস্থিতিশীল করতে পারে (চিত্র ২b, ​​৬a)। আমরা সবচেয়ে শক্তিশালী ursolic অ্যাসিড ডেরিভেটিভ, KAND 11, কম ঘনত্বে (১৫ μM) পরীক্ষা করেছি এবং দেখেছি যে KAND 11 এর প্রয়োগ মূলের বৃদ্ধিকে বাধা দেয় এবং মূলের বৃদ্ধির দিকটি অসম ছিল, যদিও তারা বাম দিকে ঢালু হওয়ার প্রবণতা রাখে (চিত্র C3)। যেহেতু মাইক্রোটিউবুল-অস্থিতিশীলকারী ওষুধের উচ্চ ঘনত্ব কখনও কখনও মূলের কাত হওয়ার পরিবর্তে উদ্ভিদের বৃদ্ধিকে বাধা দেয়, তাই আমরা পরবর্তীতে মূলের এপিডার্মাল কোষগুলিতে কর্টিকাল মাইক্রোটিউবুলগুলি পর্যবেক্ষণ করে KAND 11 মাইক্রোটিউবুলগুলিকে প্রভাবিত করার সম্ভাবনা মূল্যায়ন করেছি। ২৫ μM KAND 11 দিয়ে চিকিত্সা করা চারাগাছের শিকড়ের এপিডার্মাল কোষে অ্যান্টি-β-টিউবুলিন অ্যান্টিবডি ব্যবহার করে ইমিউনোহিস্টোকেমিস্ট্রিতে দেখা গেছে যে, এলোঙ্গেশন জোনের এপিডার্মাল কোষের প্রায় সমস্ত কর্টিকাল মাইক্রোটিউবুল অদৃশ্য হয়ে গেছে (চিত্র ৬খ)। এই ফলাফলগুলি ইঙ্গিত দেয় যে কুমামোটোনিক অ্যাসিড এবং এর ডেরিভেটিভগুলি মাইক্রোটিউবুলগুলিকে ব্যাহত করার জন্য প্রত্যক্ষ বা পরোক্ষভাবে কাজ করে এবং এই যৌগগুলি হল নতুন মাইক্রোটিউবুল ইনহিবিটার।
আরাবিডোপসিস থালিয়ানার কর্টিকাল মাইক্রোটিউবুলগুলিকে পরিবর্তন করে উরসোনিক অ্যাসিড এবং এর ডেরিভেটিভগুলি। (ক) নির্দেশিত ঘনত্বে বিভিন্ন উরমোটোনিক অ্যাসিড ডেরিভেটিভের উপস্থিতিতে মূলের ঝোঁক কোণ পরিমাপ করা হয়। মাইক্রোটিউবুলগুলিকে বাধা দেওয়ার জন্য পরিচিত দুটি যৌগের প্রভাব: ডিসোপাইরামাইড এবং অরিজালিনও বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। ইনসেটটি মূলের বৃদ্ধির কোণ পরিমাপের জন্য ব্যবহৃত মানটি দেখায়। তারকাচিহ্নগুলি নকল চিকিৎসার সাথে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য নির্দেশ করে (t পরীক্ষা, p< ০.০৫). n>১৯. স্কেল বার = ১ সেমি। (খ) বর্ধিত অঞ্চলে এপিডার্মাল কোষে কর্টিকাল মাইক্রোটিউবুল। ২৫ μM KAND ১১ সহ বা ছাড়া MS প্লেটে জন্মানো বন্য-প্রকার অ্যারাবিডোপসিস কোল শিকড়ের মাইক্রোটিউবুলগুলি β-টিউবুলিন প্রাথমিক অ্যান্টিবডি এবং অ্যালেক্সা ফ্লুর-কনজুগেটেড সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি ব্যবহার করে ইমিউনোহিস্টোকেমিক্যাল স্টেইনিং দ্বারা দৃশ্যমান করা হয়েছিল। স্কেল বার = ১০ μm। (গ) মূল মেরিস্টেমে মাইক্রোটিউবুলের মাইটোটিক কাঠামো। ইমিউনোহিস্টোকেমিক্যাল স্টেইনিং ব্যবহার করে মাইক্রোটিউবুলগুলি দৃশ্যমান করা হয়েছিল। কনফোকাল চিত্র থেকে প্রোফেজ জোন, স্পিন্ডেল এবং ফ্র্যাগমোপ্লাস্ট সহ মাইটোটিক কাঠামো গণনা করা হয়েছিল। তীরগুলি মাইটোটিক মাইক্রোটিউবুল কাঠামো নির্দেশ করে। নকল চিকিত্সার সাথে তারকাচিহ্নগুলি উল্লেখযোগ্য পার্থক্য নির্দেশ করে (t পরীক্ষা, p< ০.০৫). n>9. স্কেল বার = 50 µm।
যদিও উরসার মাইক্রোটিউবুলের কার্যকারিতা ব্যাহত করার ক্ষমতা রয়েছে, তবুও এর ক্রিয়া প্রক্রিয়াটি সাধারণ মাইক্রোটিউবুল ডিপলিমারাইজিং এজেন্টগুলির থেকে আলাদা বলে আশা করা হচ্ছে। উদাহরণস্বরূপ, ডিসোপাইরামাইড এবং অরিজালিনের মতো মাইক্রোটিউবুল ডিপলিমারাইজিং এজেন্টের উচ্চ ঘনত্ব এপিডার্মাল কোষগুলির অ্যানিসোট্রপিক প্রসারণকে প্ররোচিত করে, যেখানে KAND 11 তা করে না। এছাড়াও, KAND 11 এবং ডিসোপাইরামাইডের যৌথ প্রয়োগের ফলে ডিসোপাইরামাইড-প্ররোচিত মূল বৃদ্ধির প্রতিক্রিয়া দেখা গেছে এবং KAND 11-প্ররোচিত বৃদ্ধি বাধা লক্ষ্য করা গেছে (চিত্র S4)। আমরা KAND 11-এর প্রতি অতি সংবেদনশীল ডিসোপাইরামাইড 1-1 (phs1-1) মিউট্যান্টের প্রতিক্রিয়াও বিশ্লেষণ করেছি। phs1-1-এর একটি নন-ক্যানোনিকাল টিউবুলিন কাইনেজ পয়েন্ট মিউটেশন রয়েছে এবং ডিসোপাইরামাইড দিয়ে চিকিত্সা করা হলে ছোট শিকড় তৈরি করে9,20। KAND 11 ধারণকারী আগর মাধ্যমে জন্মানো phs1-1 মিউট্যান্ট চারাগুলির ডিসোপাইরামিডের মতো ছোট শিকড় ছিল (চিত্র S5)।
এছাড়াও, আমরা KAND 11 দিয়ে চিকিত্সা করা চারাগুলির মূল মেরিস্টেমে মাইটোটিক মাইক্রোটিউবুলের কাঠামো, যেমন প্রোফেজ জোন, স্পিন্ডেল এবং ফ্র্যাগমোপ্লাস্ট পর্যবেক্ষণ করেছি। CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS-এর পর্যবেক্ষণের সাথে সামঞ্জস্য রেখে, মাইটোটিক মাইক্রোটিউবুলের সংখ্যায় উল্লেখযোগ্য হ্রাস লক্ষ্য করা গেছে (চিত্র .6c)।
উপকোষীয় রেজোলিউশনে KAND 11 এর সাইটোটক্সিসিটি চিহ্নিত করার জন্য, আমরা KAND 11 দিয়ে তামাক BY-2 সাসপেনশন কোষের চিকিৎসা করেছি এবং তাদের প্রতিক্রিয়া পর্যবেক্ষণ করেছি। কর্টিকাল মাইক্রোটিউবুলের উপর KAND 11 এর প্রভাব মূল্যায়ন করার জন্য আমরা প্রথমে TagRFP-TUA6 প্রকাশকারী BY-2 কোষের সাথে KAND 11 যুক্ত করেছি, যা ফ্লুরোসেন্টলি মাইক্রোটিউবুল লেবেল করে। চিত্র বিশ্লেষণ ব্যবহার করে কর্টিকাল মাইক্রোটিউবুলের ঘনত্ব মূল্যায়ন করা হয়েছিল, যা সাইটোপ্লাজমিক পিক্সেলের মধ্যে সাইটোস্কেলিটাল পিক্সেলের শতাংশ পরিমাপ করেছিল। পরীক্ষার ফলাফলে দেখা গেছে যে 50 μM বা 100 μM KAND 11 দিয়ে 1 ঘন্টা ধরে চিকিৎসার পর, ঘনত্ব উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়ে যথাক্রমে 0.94 ± 0.74% বা 0.23 ± 0.28% হয়েছে, যেখানে DMSO দিয়ে চিকিৎসা করা কোষের ঘনত্ব 1.61 ± 0.34% (চিত্র 7a)। এই ফলাফলগুলি Arabidopsis-এর পর্যবেক্ষণের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ যে KAND 11 চিকিৎসা কর্টিকাল মাইক্রোটিউবুলের ডিপলিমারাইজেশনকে প্ররোচিত করে (চিত্র 6b)। আমরা KAND 11-এর একই ঘনত্বের চিকিৎসার পরে GFP-ABD-লেবেলযুক্ত অ্যাক্টিন ফিলামেন্ট সহ BY-2 লাইনটিও পরীক্ষা করে দেখেছি যে KAND 11 চিকিৎসা অ্যাক্টিন ফিলামেন্টগুলিকে ব্যাহত করেছে। 50 μM বা 100 μM KAND 11 দিয়ে 1 ঘন্টা ধরে চিকিৎসা উল্লেখযোগ্যভাবে অ্যাক্টিন ফিলামেন্টের ঘনত্বকে 1.20 ± 0.62% বা 0.61 ± 0.26% এ হ্রাস করেছে, যেখানে DMSO-চিকিত্সা করা কোষগুলিতে ঘনত্ব ছিল 1.69 ± 0.51% (চিত্র 2)। 7b)। এই ফলাফলগুলি প্রোপিজামাইডের প্রভাবের সাথে বিপরীত, যা অ্যাক্টিন ফিলামেন্টগুলিকে প্রভাবিত করে না এবং ল্যাট্রুনকুলিন B, একটি অ্যাক্টিন ডিপলিমারাইজার যা মাইক্রোটিউবুলকে প্রভাবিত করে না (SI চিত্র S6)। এছাড়াও, coumamonamide 1, coumamonamide অ্যাসিড 6, অথবা KAND 11 দিয়ে চিকিৎসা HeLa কোষের মাইক্রোটিউবুলগুলিকে প্রভাবিত করেনি (SI চিত্র S7)। সুতরাং, KAND 11 এর ক্রিয়া প্রক্রিয়া পরিচিত সাইটোস্কেলটন বিঘ্নকারীর থেকে আলাদা বলে মনে করা হয়। এছাড়াও, KAND 11 দিয়ে চিকিৎসা করা BY-2 কোষের আমাদের মাইক্রোস্কোপিক পর্যবেক্ষণ KAND 11 চিকিৎসার সময় কোষের মৃত্যুর সূত্রপাত প্রকাশ করেছে এবং দেখিয়েছে যে KAND 11 চিকিৎসার 30 মিনিট পরে ইভান্স নীল-দাগযুক্ত মৃত কোষের অনুপাত উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পায়নি, যেখানে 50 μM বা 100 μM KAND দিয়ে 90 মিনিটের চিকিৎসার পরে, মৃত কোষের সংখ্যা যথাক্রমে 43.7% বা 80.1% বৃদ্ধি পেয়েছে (চিত্র 7c)। একসাথে নেওয়া হলে, এই তথ্যগুলি নির্দেশ করে যে নতুন ursolic অ্যাসিড ডেরিভেটিভ KAND 11 হল একটি উদ্ভিদ-নির্দিষ্ট সাইটোস্কেলিটাল ইনহিবিটর যার কর্মের পূর্বে অজানা প্রক্রিয়া রয়েছে।
KAND কর্টিকাল মাইক্রোটিউবুল, অ্যাক্টিন ফিলামেন্ট এবং তামাকের BY-2 কোষের কার্যকারিতাকে প্রভাবিত করে। (a) TagRFP-TUA6 এর উপস্থিতিতে BY-2 কোষে কর্টিকাল মাইক্রোটিউবুলের ভিজ্যুয়ালাইজেশন। KAND 11 (50 μM বা 100 μM) বা DMSO দিয়ে চিকিত্সা করা BY-2 কোষগুলি কনফোকাল মাইক্রোস্কোপি দ্বারা পরীক্ষা করা হয়েছিল। 25টি স্বাধীন কোষের মাইক্রোগ্রাফ থেকে কর্টিকাল মাইক্রোটিউবুলের ঘনত্ব গণনা করা হয়েছিল। অক্ষরগুলি উল্লেখযোগ্য পার্থক্য নির্দেশ করে (Tukey HSD পরীক্ষা, p< 0.05)। স্কেল বার = 10 µm। (b) GFP-ABD2 এর উপস্থিতিতে দৃশ্যমান BY-2 কোষে কর্টিকাল অ্যাক্টিন ফিলামেন্ট। KAND 11 (50 μM বা 100 μM) বা DMSO দিয়ে চিকিত্সা করা BY-2 কোষগুলি কনফোকাল মাইক্রোস্কোপি দ্বারা পরীক্ষা করা হয়েছিল। কর্টিকাল অ্যাক্টিন ফিলামেন্টের ঘনত্ব 25টি স্বাধীন কোষের মাইক্রোগ্রাফ থেকে গণনা করা হয়েছিল। অক্ষরগুলি উল্লেখযোগ্য পার্থক্য নির্দেশ করে (টুকি এইচএসডি পরীক্ষা, পি)< ০.০৫)। স্কেল বার = ১০ µm। (গ) ইভান্স ব্লু স্টেইনিং দ্বারা মৃত BY-2 কোষ পর্যবেক্ষণ। KAND 11 (50 μM বা 100 μM) বা DMSO দিয়ে চিকিত্সা করা BY-2 কোষগুলি উজ্জ্বল-ক্ষেত্র মাইক্রোস্কোপি দ্বারা পরীক্ষা করা হয়েছিল। n=৩)। স্কেল বার = ১০০ µm।
নতুন প্রাকৃতিক পণ্য আবিষ্কার এবং প্রয়োগের ফলে চিকিৎসা ও কৃষিসহ মানব জীবনের বিভিন্ন ক্ষেত্রে উল্লেখযোগ্য অগ্রগতি হয়েছে। প্রাকৃতিক সম্পদ থেকে দরকারী যৌগ প্রাপ্তির জন্য ঐতিহাসিক গবেষণা পরিচালিত হয়েছে। বিশেষ করে, অ্যাক্টিনোমাইসেটগুলি নেমাটোডের জন্য অ্যান্টিপ্যারাসাইটিক অ্যান্টিবায়োটিক হিসাবে কার্যকর বলে পরিচিত কারণ তাদের বিভিন্ন গৌণ বিপাক যেমন অ্যাভারমেকটিন, আইভারমেকটিন এবং ব্লিওমাইসিনের সীসা যৌগ এবং এর ডেরিভেটিভস তৈরির ক্ষমতা রয়েছে, যা ক্যান্সার প্রতিরোধক এজেন্ট হিসাবে ঔষধিভাবে ব্যবহৃত হয়21,22। একইভাবে, অ্যাক্টিনোমাইসেট থেকে বিভিন্ন ধরণের ভেষজনাশক যৌগ আবিষ্কৃত হয়েছে, যার মধ্যে কিছু ইতিমধ্যে বাণিজ্যিকভাবে ব্যবহৃত হচ্ছে1,23। অতএব, পছন্দসই জৈবিক ক্রিয়াকলাপ সহ প্রাকৃতিক পণ্যগুলিকে আলাদা করার জন্য অ্যাক্টিনোমাইসেট বিপাক বিশ্লেষণকে একটি কার্যকর কৌশল হিসাবে বিবেচনা করা হয়। এই গবেষণায়, আমরা S. werraensis থেকে একটি নতুন যৌগ, coumamonamide আবিষ্কার করেছি এবং সফলভাবে এটি সংশ্লেষিত করেছি। Ursonic অ্যাসিড হল urbenamide এবং এর ডেরিভেটিভসের একটি সিন্থেটিক মধ্যবর্তী। এটি বৈশিষ্ট্যগত মূল কুঁচকানোর কারণ হতে পারে, মাঝারি থেকে শক্তিশালী ভেষজনাশক কার্যকলাপ প্রদর্শন করতে পারে এবং প্রত্যক্ষ বা পরোক্ষভাবে উদ্ভিদের মাইক্রোটিউবুলগুলিকে ক্ষতি করতে পারে। তবে, উরমোটোনিক অ্যাসিডের ক্রিয়া প্রক্রিয়া বিদ্যমান মাইক্রোটিউবুল ইনহিবিটরগুলির থেকে ভিন্ন হতে পারে, কারণ KAND 11 অ্যাক্টিন ফিলামেন্টগুলিকেও ব্যাহত করে এবং কোষের মৃত্যু ঘটায়, যা একটি নিয়ন্ত্রক প্রক্রিয়া নির্দেশ করে যার মাধ্যমে উরমোটোনিক অ্যাসিড এবং এর ডেরিভেটিভগুলি বিস্তৃত সাইটোস্কেলিটাল কাঠামোকে প্রভাবিত করে।
আরবেনোনিক অ্যাসিডের আরও বিস্তারিত বৈশিষ্ট্য বর্ণনা করলে আরবেনোনিক অ্যাসিডের ক্রিয়া প্রক্রিয়া আরও ভালোভাবে বুঝতে সাহায্য করবে। বিশেষ করে, পরবর্তী লক্ষ্য হল উরসোনিক অ্যাসিডের হ্রাসপ্রাপ্ত মাইক্রোটিউবুলের সাথে আবদ্ধ হওয়ার ক্ষমতা মূল্যায়ন করা যাতে নির্ধারণ করা যায় যে উরসোনিক অ্যাসিড এবং এর ডেরিভেটিভগুলি সরাসরি মাইক্রোটিউবুলের উপর কাজ করে এবং তাদের ডিপলিমারাইজ করে কিনা, নাকি তাদের ক্রিয়া মাইক্রোটিউবুলের অস্থিতিশীলতার দিকে পরিচালিত করে। এছাড়াও, যেখানে মাইক্রোটিউবুলগুলি সরাসরি লক্ষ্যবস্তু নয়, সেখানে উদ্ভিদ কোষে উরসোনিক অ্যাসিডের ক্রিয়া স্থান এবং আণবিক লক্ষ্যবস্তু সনাক্তকরণ সম্পর্কিত যৌগগুলির বৈশিষ্ট্য এবং ভেষজনাশক কার্যকলাপ উন্নত করার সম্ভাব্য উপায়গুলি আরও বুঝতে সাহায্য করবে। আমাদের জৈবিক ক্রিয়াকলাপ পরীক্ষা অ্যারাবিডোপসিস থালিয়ানা, তামাক এবং লিভারওয়ার্টের মতো উদ্ভিদের বৃদ্ধিতে উরসোনিক অ্যাসিডের অনন্য সাইটোটক্সিক ক্ষমতা প্রকাশ করেছে, যদিও ই. কোলাই বা হেলা কোষগুলি প্রভাবিত হয়নি। উন্মুক্ত কৃষিক্ষেত্রে ব্যবহারের জন্য ভেষজনাশক হিসাবে বিকশিত হলে প্রাণী কোষের জন্য সামান্য বা কোনও বিষাক্ততা নেই উরসোনিক অ্যাসিড ডেরিভেটিভগুলির একটি সুবিধা। প্রকৃতপক্ষে, যেহেতু মাইক্রোটিউবুলগুলি ইউক্যারিওটে সাধারণ কাঠামো, তাই উদ্ভিদে তাদের নির্বাচনী বাধা ভেষজনাশকের জন্য একটি গুরুত্বপূর্ণ প্রয়োজনীয়তা। উদাহরণস্বরূপ, প্রোপিজামাইড, একটি মাইক্রোটিউবুল ডিপোলিমারাইজিং এজেন্ট যা সরাসরি টিউবুলিনের সাথে আবদ্ধ হয় এবং পলিমারাইজেশনকে বাধা দেয়, এটি প্রাণী কোষের সাথে কম বিষাক্ততার কারণে ভেষজনাশক হিসাবে ব্যবহৃত হয়। ডিসোপাইরামাইডের বিপরীতে, সম্পর্কিত বেনজামাইডগুলির বিভিন্ন লক্ষ্য নির্দিষ্টতা রয়েছে। উদ্ভিদ মাইক্রোটিউবুল ছাড়াও, RH-4032 বা বেনজোক্সামাইড যথাক্রমে প্রাণী কোষ বা ওমাইসেটের মাইক্রোটিউবুলগুলিকেও বাধা দেয় এবং জালিলামাইড তার কম ফাইটোটক্সিসিটি 25,26,27 এর কারণে ছত্রাকনাশক হিসাবে ব্যবহৃত হয়। নতুন আবিষ্কৃত ভালুক এবং এর ডেরিভেটিভগুলি উদ্ভিদের বিরুদ্ধে নির্বাচনী সাইটোটক্সিসিটি প্রদর্শন করে, তবে এটি লক্ষণীয় যে আরও পরিবর্তনগুলি তাদের লক্ষ্য নির্দিষ্টতা পরিবর্তন করতে পারে, সম্ভাব্যভাবে রোগজীবাণু ছত্রাক বা ওমাইসেট নিয়ন্ত্রণের জন্য অতিরিক্ত ডেরিভেটিভ সরবরাহ করে।
আরবেনোনিক অ্যাসিড এবং এর ডেরিভেটিভের অনন্য বৈশিষ্ট্যগুলি ভেষজনাশক হিসাবে তাদের বিকাশ এবং গবেষণার হাতিয়ার হিসাবে ব্যবহারের জন্য কার্যকর। উদ্ভিদ কোষের আকৃতি নিয়ন্ত্রণে সাইটোস্কেলটনের গুরুত্ব ব্যাপকভাবে স্বীকৃত। পূর্ববর্তী গবেষণায় দেখা গেছে যে উদ্ভিদগুলি কর্টিকাল মাইক্রোটিউবুল সংগঠনের জটিল প্রক্রিয়াগুলি বিকশিত করেছে মাইক্রোটিউবুল গতিবিদ্যা নিয়ন্ত্রণ করে সঠিকভাবে মরফোজেনেসিস নিয়ন্ত্রণ করার জন্য। মাইক্রোটিউবুল কার্যকলাপ নিয়ন্ত্রণের জন্য দায়ী বিপুল সংখ্যক অণু চিহ্নিত করা হয়েছে এবং সম্পর্কিত গবেষণা এখনও চলছে3,4,28। উদ্ভিদ কোষে মাইক্রোটিউবুল গতিবিদ্যা সম্পর্কে আমাদের বর্তমান ধারণা কর্টিকাল মাইক্রোটিউবুল সংগঠনের প্রক্রিয়াগুলি সম্পূর্ণরূপে ব্যাখ্যা করে না। উদাহরণস্বরূপ, যদিও ডিসোপাইরামাইড এবং অরিজালিন উভয়ই মাইক্রোটিউবুলকে ডিপলিমারাইজ করতে পারে, ডিসোপাইরামাইড গুরুতর মূল বিকৃতি ঘটায় যেখানে অরিজালিনের তুলনামূলকভাবে হালকা প্রভাব রয়েছে। অধিকন্তু, টিউবুলিনে মিউটেশন, যা মাইক্রোটিউবুলকে স্থিতিশীল করে, শিকড়গুলিতে ডেক্সট্রোরোটেশনও ঘটায়, যেখানে প্যাক্লিট্যাক্সেল, যা মাইক্রোটিউবুল গতিবিদ্যাও স্থিতিশীল করে, তা করে না। অতএব, উরসোলিক অ্যাসিডের আণবিক লক্ষ্যগুলি অধ্যয়ন এবং সনাক্তকরণ উদ্ভিদ কর্টিকাল মাইক্রোটিউবুলের নিয়ন্ত্রণ সম্পর্কে নতুন অন্তর্দৃষ্টি প্রদান করবে। একইভাবে, বিকৃত বৃদ্ধিকে উৎসাহিত করতে কার্যকর রাসায়নিক, যেমন ডিসোপাইরামাইড, এবং কম কার্যকর রাসায়নিক, যেমন অরিজালিন বা কুমামোটোরিক অ্যাসিড, ভবিষ্যতের তুলনা কীভাবে বিকৃত বৃদ্ধি ঘটে তার সূত্র প্রদান করবে।
অন্যদিকে, প্রতিরক্ষা-সম্পর্কিত সাইটোস্কেলিটাল পুনর্বিন্যাস হল উরসোনিক অ্যাসিডের সাইটোটক্সিসিটি ব্যাখ্যা করার আরেকটি সম্ভাবনা। উদ্ভিদ কোষে কোনও রোগজীবাণুর সংক্রমণ বা এলিসিটরের প্রবেশ কখনও কখনও সাইটোস্কেলিটনের ধ্বংস এবং পরবর্তী কোষের মৃত্যু ঘটায়। উদাহরণস্বরূপ, ওমাইসেট থেকে প্রাপ্ত ক্রিপ্টোক্সানথিন তামাক কোষের মৃত্যুর আগে মাইক্রোটিউবুল এবং অ্যাক্টিন ফিলামেন্টগুলিকে ব্যাহত করে বলে জানা গেছে, যা KAND চিকিৎসার সাথে ঘটে 30,31 এর মতো। প্রতিরক্ষা প্রতিক্রিয়া এবং উরসোনিক অ্যাসিড দ্বারা প্ররোচিত কোষীয় প্রতিক্রিয়ার মধ্যে মিল আমাদের অনুমান করতে পরিচালিত করে যে তারা সাধারণ কোষীয় প্রক্রিয়াগুলিকে ট্রিগার করে, যদিও ক্রিপ্টোক্সানথিনের তুলনায় উরসোনিক অ্যাসিডের দ্রুত এবং শক্তিশালী প্রভাব স্পষ্ট। যাইহোক, গবেষণায় দেখা গেছে যে অ্যাক্টিন ফিলামেন্টের ব্যাহততা স্বতঃস্ফূর্ত কোষের মৃত্যুকে উৎসাহিত করে, যা সর্বদা মাইক্রোটিউবুল ব্যাহত হয় না 29। এছাড়াও, এটি দেখা বাকি আছে যে রোগজীবাণু বা এলিসিটর উভয়ই বিকৃত মূল বৃদ্ধি ঘটায় কিনা, যেমন উরসোনিক অ্যাসিড ডেরিভেটিভস করে। সুতরাং, প্রতিরক্ষা প্রতিক্রিয়া এবং সাইটোস্কেলিটনের সংযোগকারী আণবিক জ্ঞান একটি আকর্ষণীয় সমস্যা যা সমাধান করা উচিত। উরসোনিক অ্যাসিডের সাথে সম্পর্কিত কম আণবিক ওজনের যৌগের উপস্থিতি, এবং বিভিন্ন ক্ষমতাসম্পন্ন বিভিন্ন ডেরিভেটিভের উপস্থিতি কাজে লাগিয়ে, তারা অজানা কোষীয় প্রক্রিয়াগুলিকে লক্ষ্য করার সুযোগ প্রদান করতে পারে।
একসাথে, মাইক্রোটিউবুলের গতিবিদ্যা নিয়ন্ত্রণকারী নতুন যৌগগুলির আবিষ্কার এবং প্রয়োগ উদ্ভিদ কোষের আকৃতি নির্ধারণের অন্তর্নিহিত জটিল আণবিক প্রক্রিয়াগুলিকে মোকাবেলা করার জন্য শক্তিশালী পদ্ধতি প্রদান করবে। এই প্রসঙ্গে, সম্প্রতি বিকশিত যৌগ উরমোটোনিক অ্যাসিড, যা মাইক্রোটিউবুল এবং অ্যাক্টিন ফিলামেন্টগুলিকে প্রভাবিত করে এবং কোষের মৃত্যুকে প্ররোচিত করে, মাইক্রোটিউবুল নিয়ন্ত্রণ এবং এই অন্যান্য প্রক্রিয়াগুলির মধ্যে সংযোগ বোঝার সুযোগ প্রদান করতে পারে। সুতরাং, উরবেনোনিক অ্যাসিড ব্যবহার করে রাসায়নিক এবং জৈবিক বিশ্লেষণ আমাদের উদ্ভিদের সাইটোস্কেলটন নিয়ন্ত্রণকারী আণবিক নিয়ন্ত্রক প্রক্রিয়াগুলি বুঝতে সাহায্য করবে।
S. werraensis MK493-CF1 কে ৫০০ মিলি বিস্মিত Erlenmeyer ফ্লাস্কে টিকা দিন যাতে ১১০ মিলি বীজ মাধ্যমের মিশ্রণ থাকে যার মধ্যে ২% (w/v) গ্যালাকটোজ, ২% (w/v) এসেন্স পেস্ট, ১% (w/v) ব্যাক্টো কম্পোজিশন থাকে। -সয়টন (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক, ইনকর্পোরেটেড), ০.৫% (w/v) ভুট্টার নির্যাস (KOGOSTCH কোং লিমিটেড, জাপান), ০.২% (w/v) (NH4)2SO4 এবং ০.২% CaCO3 ডিআয়োনাইজড জলে। (জীবাণুমুক্তকরণের আগে pH ৭.৪)। বীজ কালচারগুলিকে একটি ঘূর্ণায়মান শেকারে (১৮০ rpm) ২৭°C তাপমাত্রায় ২ দিন ধরে ইনকিউব করা হয়েছিল। কঠিন অবস্থায় গাঁজন পদ্ধতির মাধ্যমে উৎপাদন চাষ। বীজ কালচার (৭ মিলি) ৫০০ মিলি K-১ ফ্লাস্কে স্থানান্তরিত করা হয়েছিল, যেখানে ৪০ গ্রাম উৎপাদন মাধ্যমের ১৫ গ্রাম চাপা বার্লি (MUSO Co., Ltd., জাপান) এবং ২৫ গ্রাম ডিআয়োনাইজড জল (জীবাণুমুক্তকরণের আগে pH সামঞ্জস্য করা হয়নি) ছিল। ৩০°C তাপমাত্রায় ১৪ দিন ধরে অন্ধকারে গাঁজন করা হয়েছিল। গাঁজন উপাদানটি ৪০ মিলি/বোতল EtOH দিয়ে বের করা হয়েছিল এবং সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল (১৫০০ গ্রাম, ৪°C, ১০ মিনিট)। কালচার সুপারনেট্যান্ট (৬০ মিলি) ১০% MeOH/EtOAc মিশ্রণ দিয়ে বের করা হয়েছিল। জৈব স্তরটি হ্রাসপ্রাপ্ত চাপে বাষ্পীভূত হয়ে একটি অবশিষ্টাংশ (59.5 মিলিগ্রাম) প্রাপ্ত হয়, যা বিপরীত ফেজ কলামে (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 মিমি × দৈর্ঘ্য 250 মিমি) গ্রেডিয়েন্ট এলিউশন (0-10 মিনিট: 90%) সহ HPLC-এর অধীনে আনা হয়েছিল। H2O/CH3CN, 10-35 মিনিট: 90% H2O/CH3CN থেকে 70% H2O/CH3CN (গ্রেডিয়েন্ট), 35-45 মিনিট: 90% H2O/EtOH, 45-155 মিনিট: 90% H2O/EtOH থেকে 100% EtOH (গ্রেডিয়েন্ট (গ্রেডিয়েন্ট), 155-200 মিনিট: 100% EtOH) 1.5 মিলি/মিনিট প্রবাহ হারে, কুমামোনামাইড (1, 36.0 মিলিগ্রাম) একটি সাদা নিরাকার পাউডার হিসাবে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল।
কুমামোটোঅ্যামাইড(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H)। ), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ গণনা করা মান: 141.0659, পরিমাপ করা মান: 141.0663, IR νসর্বোচ্চ 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 সেমি–1।
কলাম্বিয়ার বীজ (Col-0) গবেষণা ব্যবহারের অনুমতি নিয়ে Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) থেকে সংগ্রহ করা হয়েছিল। Col-0 বীজ আমাদের পরীক্ষাগারের পরিবেশে প্রচার ও রক্ষণাবেক্ষণ করা হয়েছিল এবং বন্য ধরণের Arabidopsis উদ্ভিদ হিসেবে ব্যবহার করা হয়েছিল। Arabidopsis বীজগুলিকে পৃষ্ঠতল জীবাণুমুক্ত করে চাষ করা হয়েছিল এবং অর্ধ-শক্তি মুরাশিগে এবং স্কুগ মাধ্যমে ২% সুক্রোজ (Fujifilm Wako Pure Chemical), ০.০৫% (w/v) 2-(4-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) এবং ১.৫% আগর (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH ৫.৭, ২৩ °C তাপমাত্রায় এবং ধ্রুবক আলোতে ধারণকারী অর্ধ-শক্তির Murashige এবং Skoog মাধ্যমের মাধ্যমে চাষ করা হয়েছিল। phs1-1 মিউট্যান্টের বীজ T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) দ্বারা সরবরাহ করা হয়েছিল।
SR-1 প্রজাতির বীজ টি. হাশিমোটো (নারা ইনস্টিটিউট অফ সায়েন্স অ্যান্ড টেকনোলজি) দ্বারা সরবরাহ করা হয়েছিল এবং বন্য ধরণের তামাক গাছ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। তামাকের বীজগুলিকে পৃষ্ঠতল জীবাণুমুক্ত করা হয়েছিল এবং অঙ্কুরোদগম বৃদ্ধির জন্য তিন রাত জীবাণুমুক্ত জলে ভিজিয়ে রাখা হয়েছিল, তারপর pH 5.7 সহ 2% সুক্রোজ, 0.05% (w/v) MES এবং 0.8% জেলান গাম (ফুজিফিল্ম ওয়াকো পিওর কেমিক্যাল) মুরাশিগে এবং স্কুগ মিডিয়াম ধারণকারী একটি অর্ধ-শক্তি দ্রবণে রাখা হয়েছিল এবং 23°C তাপমাত্রায় ধ্রুবক আলোতে সেদ্ধ করা হয়েছিল।
স্ট্রেন টাক-১ টি. কোহচি (কিয়োটো বিশ্ববিদ্যালয়) দ্বারা সরবরাহ করা হয়েছিল এবং লিভারওয়ার্ট গবেষণার জন্য আদর্শ পরীক্ষামূলক ইউনিট হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। জেমা জীবাণুমুক্ত কালচারড উদ্ভিদ থেকে প্রাপ্ত করা হয়েছিল এবং তারপরে ১% সুক্রোজ এবং ০.৩% জেলান গামযুক্ত গ্যামবর্গ বি৫ মিডিয়াম (ফুজিফিল্ম ওয়াকো পিওর কেমিক্যাল) এর উপর প্রলেপ দেওয়া হয়েছিল এবং অবিচ্ছিন্ন আলোতে ২৩°C তাপমাত্রায় ইনকিউবেটেড করা হয়েছিল।
তামাকের BY-2 কোষ (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) S. Hasezawa (Tokyo University) দ্বারা সরবরাহ করা হয়েছিল। BY-2 কোষগুলিকে পরিবর্তিত Linsmeier এবং Skoog মাধ্যমে 95-গুণ পাতলা করা হয়েছিল এবং প্রতি সপ্তাহে 2,4-dichlorophenoxyacetic acid 32 দিয়ে পরিপূরক করা হয়েছিল। অন্ধকারে 27°C তাপমাত্রায় 130 rpm তাপমাত্রায় একটি ঘূর্ণমান শেকারে কোষ সাসপেনশন মিশ্রিত করা হয়েছিল। তাজা মাধ্যমের 10 গুণ আয়তন দিয়ে কোষগুলি ধুয়ে একই মাধ্যমে পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল। BY-2 ট্রান্সজেনিক কোষ লাইনগুলি স্থিরভাবে মাইক্রোটিউবুল মার্কার TagRFP-TUA6 বা ফুলকপি মোজাইক ভাইরাস 35S প্রোমোটারের অধীনে অ্যাক্টিন ফিলামেন্ট মার্কার GFP-ABD2 প্রকাশ করে 33,34,35 বর্ণিত পদ্ধতি অনুসারে তৈরি করা হয়েছিল। এই কোষ লাইনগুলি মূল BY-2 কোষ লাইনের জন্য ব্যবহৃত পদ্ধতিগুলির অনুরূপ পদ্ধতি ব্যবহার করে রক্ষণাবেক্ষণ এবং সিঙ্ক্রোনাইজ করা যেতে পারে।
হেলা কোষগুলিকে ডালবেকোর পরিবর্তিত ঈগলের মাধ্যমে (DMEM) (লাইফ টেকনোলজিস) কালচার করা হয়েছিল, যার পরিপূরক ছিল ১০% ভ্রূণ গবাদি পশুর সিরাম, ১.২ U/ml পেনিসিলিন এবং ১.২ μg/ml স্ট্রেপ্টোমাইসিন, ৩৭°C তাপমাত্রার ইনকিউবেটারে ৫% CO2 সহ।
এই পাণ্ডুলিপিতে বর্ণিত সমস্ত পরীক্ষা-নিরীক্ষা জাপানি জৈব নিরাপত্তা বিধি এবং নির্দেশিকা অনুসারে সম্পাদিত হয়েছিল।
যৌগগুলিকে ডাইমিথাইল সালফক্সাইড (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) তে স্টক দ্রবণ হিসেবে দ্রবীভূত করা হয়েছিল এবং Arabidopsis এবং তামাকের জন্য MS মাধ্যমে অথবা লিভারওয়ার্টের জন্য Gamborg B5 মাধ্যমে মিশ্রিত করা হয়েছিল। মূল বৃদ্ধি প্রতিরোধ পরীক্ষার জন্য, প্রতি প্লেটে ১০টিরও বেশি বীজ নির্দেশিত যৌগ বা DMSO ধারণকারী আগর মাধ্যমে বপন করা হয়েছিল। বীজগুলিকে ৭ দিনের জন্য একটি বৃদ্ধি চেম্বারে ইনকিউব করা হয়েছিল। চারাগুলির ছবি তোলা হয়েছিল এবং শিকড়ের দৈর্ঘ্য পরিমাপ করা হয়েছিল। Arabidopsis অঙ্কুরোদগম পরীক্ষার জন্য, প্রতি প্লেটে ৪৮টি বীজ ২০০ μM যৌগ বা DMSO ধারণকারী আগর মাধ্যমে বপন করা হয়েছিল। Arabidopsis বীজগুলি একটি বৃদ্ধি চেম্বারে জন্মানো হয়েছিল এবং অঙ্কুরোদগমের ৭ দিন পরে অঙ্কুরোদগম চারার সংখ্যা গণনা করা হয়েছিল (dag)। তামাকের অঙ্কুরোদগম পরীক্ষার জন্য, প্রতি প্লেটে ২৪টি বীজ ২০০ μM KAND বা DMSO ধারণকারী আগর মাধ্যমে বপন করা হয়েছিল। তামাকের বীজ একটি বৃদ্ধি চেম্বারে জন্মানো হয়েছিল এবং ১৪ দিন পরে অঙ্কুরোদগম চারার সংখ্যা গণনা করা হয়েছিল। লিভারওয়ার্ট বৃদ্ধি প্রতিরোধ পরীক্ষার জন্য, প্রতিটি প্লেট থেকে 9টি ভ্রূণকে KAND বা DMSO এর নির্দেশিত ঘনত্ব ধারণকারী আগর মাধ্যমের উপর প্রলেপ দেওয়া হয়েছিল এবং 14 দিনের জন্য একটি বৃদ্ধি চেম্বারে ইনকিউবেটেড করা হয়েছিল।
৫ মিলিগ্রাম/মিলি প্রোপিডিয়াম আয়োডাইড (PI) দিয়ে দাগযুক্ত চারা ব্যবহার করে মূল মেরিস্টেম সংগঠন কল্পনা করুন। TCS SPE কনফোকাল লেজার স্ক্যানিং মাইক্রোস্কোপ (Leica Microsystems) ব্যবহার করে ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপির মাধ্যমে PI সংকেত পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল।
মালামি এবং বেনফে36 দ্বারা বর্ণিত প্রোটোকল অনুসারে β-গ্লুকুরোনিডেস (GUS) দিয়ে শিকড়ের হিস্টোকেমিক্যাল দাগ দেওয়া হয়েছিল। চারাগুলিকে রাতারাতি 90% অ্যাসিটোনে স্থির করা হয়েছিল, 0.5 মিলিগ্রাম/মিলি 5-ব্রোমো-4-ক্লোরো-3-ইন্ডোলিল-β-ডি-গ্লুকুরোনিক অ্যাসিড দিয়ে GUS বাফারে 1 ঘন্টার জন্য দাগ দেওয়া হয়েছিল এবং একটি হাইড্রেটেড ক্লোরালডিহাইড দ্রবণে রাখা হয়েছিল। (8 গ্রাম ক্লোরাল হাইড্রেট, 2 মিলি জল এবং 1 মিলি গ্লিসারল) এবং একটি অ্যাক্সিও ইমেজার M1 মাইক্রোস্কোপ (কার্ল জেইস) ব্যবহার করে ডিফারেনশিয়াল ইন্টারফেরেন্স কনট্রাস্ট মাইক্রোস্কোপির মাধ্যমে পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল।
উল্লম্বভাবে স্থাপন করা প্লেটে জন্মানো ৭ দিন বয়সী চারাগাছের মূল কোণ পরিমাপ করা হয়েছিল। ধাপ ৬-এ বর্ণিত মাধ্যাকর্ষণ ভেক্টরের দিক থেকে মূলের কোণ পরিমাপ করুন।
কর্টিকাল মাইক্রোটিউবুলের বিন্যাস বর্ণিতভাবে পর্যবেক্ষণ করা হয়েছে, প্রোটোকল 37-তে সামান্য পরিবর্তন সহ। অ্যান্টি-β-টিউবুলিন অ্যান্টিবডি (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) এবং অ্যালেক্সা ফ্লুর 488-কনজুগেটেড অ্যান্টি-মাউস IgG (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক: A32723) যথাক্রমে 1:1000 এবং 1:100 ডিলিউশনে প্রাথমিক এবং মাধ্যমিক অ্যান্টিবডি হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। TCS SPE কনফোকাল লেজার স্ক্যানিং মাইক্রোস্কোপ (Leica Microsystems) ব্যবহার করে ফ্লুরোসেন্স চিত্রগুলি অর্জন করা হয়েছিল। Z-স্ট্যাক চিত্রগুলি অর্জন করুন এবং নির্মাতার নির্দেশ অনুসারে সর্বাধিক তীব্রতা অনুমান তৈরি করুন।
প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে সেল কাউন্টিং কিট 8 (ডোজিন্ডো) ব্যবহার করে HeLa কোষ বিস্তার পরীক্ষা করা হয়েছিল।
600 nm (OD600) স্পেকট্রোফটোমিটার ব্যবহার করে কালচারে কোষের ঘনত্ব পরিমাপ করে E. coli DH5α এর বৃদ্ধি বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।
ট্রান্সজেনিক BY-2 কোষে সাইটোস্কেলিটাল সংগঠন পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল একটি ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপ ব্যবহার করে যা একটি CSU-X1 কনফোকাল স্ক্যানিং ডিভাইস (Yokogawa) এবং একটি sCMOS ক্যামেরা (Zyla, Andor Technology) দিয়ে সজ্জিত ছিল। চিত্র বিশ্লেষণের মাধ্যমে সাইটোস্কেলিটাল ঘনত্ব মূল্যায়ন করা হয়েছিল, যা ImageJ সফ্টওয়্যার ব্যবহার করে বর্ণিত 38,39 হিসাবে কনফোকাল চিত্রগুলিতে সাইটোপ্লাজমিক পিক্সেলের মধ্যে সাইটোস্কেলিটাল পিক্সেলের শতাংশ পরিমাপ করেছিল।
BY-2 কোষে কোষের মৃত্যু সনাক্ত করার জন্য, কোষ সাসপেনশনের একটি অ্যালিকোট ঘরের তাপমাত্রায় 0.05% ইভান্স নীল দিয়ে 10 মিনিটের জন্য ইনকিউব করা হয়েছিল। মৃত কোষের নির্বাচিত ইভান্স নীল দাগ অক্ষত প্লাজমা ঝিল্লি দ্বারা কার্যকর কোষ থেকে রঞ্জক পদার্থের বহিষ্কারের উপর নির্ভর করে। একটি উজ্জ্বল-ক্ষেত্র মাইক্রোস্কোপ (BX53, অলিম্পাস) ব্যবহার করে দাগযুক্ত কোষগুলি পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল।
৩৭°C তাপমাত্রায় আর্দ্রতাযুক্ত ইনকিউবেটরে ১০% FBS এবং ৫% CO2 দিয়ে DMEM-তে HeLa কোষগুলি বৃদ্ধি করা হয়েছিল। কোষগুলিকে ১০০ μM KAND 11, kumamonamic acid 6, kumamonamide 1, 100 ng/ml colsemid (Gibco), অথবা 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) দিয়ে ৩৭°C তাপমাত্রায় ৬ ঘন্টার জন্য চিকিত্সা করা হয়েছিল। কোষগুলিকে ১০ মিনিটের জন্য MetOH দিয়ে এবং তারপর ঘরের তাপমাত্রায় ৫ মিনিটের জন্য অ্যাসিটেট দিয়ে স্থির করা হয়েছিল। স্থির কোষগুলিকে β-টিউবুলিন প্রাথমিক অ্যান্টিবডি (1D4A4, প্রোটিনটেক: 66240-1) দিয়ে 0.5% BSA/PBS-এ মিশ্রিত করে ২ ঘন্টার জন্য ইনকিউবেট করা হয়েছিল, TBST দিয়ে ৩ বার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল এবং তারপর Alexa Fluor গোট অ্যান্টিবডি দিয়ে ইনকিউবেট করা হয়েছিল। ৪৮৮ ১ ঘন্টা। – মাউস IgG (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক: A11001) এবং 15 ng/ml 4′,6-ডায়ামিডিনো-2-ফেনিলিনডোল (DAPI) 0.5% BSA/PBS-এ মিশ্রিত। তিনবার TBST দিয়ে ধোয়ার পর, Nikon Eclipse Ti-E ইনভার্টেড মাইক্রোস্কোপে দাগযুক্ত কোষগুলি পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল। মেটামর্ফ সফ্টওয়্যার (আণবিক ডিভাইস) ব্যবহার করে একটি ঠান্ডা হামামাতসু ORCA-R2 CCD ক্যামেরা দিয়ে ছবিগুলি তোলা হয়েছিল।