Nature.com-এ আসার জন্য আপনাকে ধন্যবাদ। আপনি যে ব্রাউজারটি ব্যবহার করছেন, সেটিতে CSS সাপোর্ট সীমিত। সর্বোত্তম ফলাফলের জন্য, আমরা আপনাকে ব্রাউজারের একটি নতুন সংস্করণ ব্যবহার করার পরামর্শ দিচ্ছি (অথবা ইন্টারনেট এক্সপ্লোরারে কম্প্যাটিবিলিটি মোড নিষ্ক্রিয় করুন)। আপাতত, নিরবচ্ছিন্ন সাপোর্ট নিশ্চিত করার জন্য, আমরা সাইটটি কোনো স্টাইলিং বা জাভাস্ক্রিপ্ট ছাড়াই প্রদর্শন করছি।
প্রাকৃতিক পণ্যের আবিষ্কার এবং উপকারী ব্যবহার মানব জীবনের উন্নতিতে সাহায্য করতে পারে। আগাছা নিয়ন্ত্রণের জন্য উদ্ভিদ বৃদ্ধি রোধকারী রাসায়নিক পদার্থ ব্যাপকভাবে আগাছানাশক হিসেবে ব্যবহৃত হয়। বিভিন্ন ধরণের আগাছানাশক ব্যবহারের প্রয়োজনের কারণে, নতুন কার্যপ্রণালীযুক্ত যৌগ শনাক্ত করার প্রয়োজন রয়েছে। এই গবেষণায়, আমরা Streptomyces werraensis MK493-CF1 থেকে একটি নতুন N-অ্যালকক্সিপাইরোল যৌগ, কৌমামোনামাইড, আবিষ্কার করেছি এবং এর সম্পূর্ণ সংশ্লেষণ প্রক্রিয়া প্রতিষ্ঠা করেছি। জৈবিক কার্যকলাপ পরীক্ষার মাধ্যমে, আমরা আবিষ্কার করেছি যে উরস-মনোঅ্যামিক অ্যাসিড হলো উরস-মনোঅ্যামাইডের একটি সংশ্লেষিত মধ্যবর্তী যৌগ এবং একটি সম্ভাব্যউদ্ভিদের বৃদ্ধি প্রতিরোধকএছাড়াও, আমরা বিভিন্ন আরবেনোনিক অ্যাসিড ডেরিভেটিভ তৈরি করেছি, যার মধ্যে আরবেনাইলোক্সি ডেরিভেটিভ (UDA) অন্তর্ভুক্ত, যা HeLa কোষের বৃদ্ধিতে কোনো নেতিবাচক প্রভাব না ফেলেই উচ্চ আগাছানাশক কার্যকারিতা প্রদর্শন করে। আমরা আরও দেখেছি যে আরমোটোনিক অ্যাসিড ডেরিভেটিভ উদ্ভিদের মাইক্রোটিউবিউলকে ব্যাহত করে; উপরন্তু, KAND অ্যাকটিন ফিলামেন্টকে প্রভাবিত করে এবং কোষের মৃত্যু ঘটায়; এই বহুমুখী প্রভাবগুলো পরিচিত মাইক্রোটিউবিউল ইনহিবিটরগুলোর থেকে ভিন্ন এবং আরসোনিক অ্যাসিডের জন্য একটি নতুন কার্যপ্রণালীর ইঙ্গিত দেয়, যা নতুন আগাছানাশক তৈরির ক্ষেত্রে একটি গুরুত্বপূর্ণ সুবিধা।
উপকারী প্রাকৃতিক পণ্য এবং তাদের থেকে প্রাপ্ত উপাদানের আবিষ্কার ও ব্যবহারিক প্রয়োগ মানব জীবনের মান উন্নয়নের একটি উপায়। অণুজীব, উদ্ভিদ এবং কীটপতঙ্গ দ্বারা উৎপাদিত সেকেন্ডারি মেটাবোলাইট চিকিৎসা ও কৃষিক্ষেত্রে ব্যাপক অগ্রগতি এনেছে। প্রাকৃতিক পণ্য থেকে অনেক অ্যান্টিবায়োটিক এবং লিউকেমিয়া-বিরোধী ওষুধ তৈরি করা হয়েছে। এছাড়াও, বিভিন্ন ধরণেরকীটনাশককৃষিক্ষেত্রে ব্যবহারের জন্য এই প্রাকৃতিক পণ্যগুলো থেকে ছত্রাকনাশক ও আগাছানাশক নিষ্কাশন করা হয়। বিশেষ করে, আধুনিক কৃষিতে ফসলের ফলন বাড়ানোর জন্য আগাছা নিয়ন্ত্রণকারী হার্বিসাইডগুলো গুরুত্বপূর্ণ উপকরণ, এবং বিভিন্ন ধরণের যৌগ ইতিমধ্যেই বাণিজ্যিকভাবে ব্যবহৃত হচ্ছে। উদ্ভিদের বেশ কিছু কোষীয় প্রক্রিয়া, যেমন সালোকসংশ্লেষণ, অ্যামিনো অ্যাসিড বিপাক, কোষ প্রাচীর সংশ্লেষণ, মাইটোসিস নিয়ন্ত্রণ, ফাইটো হরমোন সংকেত, বা প্রোটিন সংশ্লেষণকে হার্বিসাইডের সাধারণ লক্ষ্যবস্তু হিসেবে বিবেচনা করা হয়। যে যৌগগুলো মাইক্রোটিউবিউলের কার্যকারিতা ব্যাহত করে, সেগুলো হার্বিসাইডের একটি সাধারণ শ্রেণি যা মাইটোটিক নিয়ন্ত্রণকে প্রভাবিত করার মাধ্যমে উদ্ভিদের বৃদ্ধিকে প্রভাবিত করে।
মাইক্রোটিউবিউল হলো সাইটোস্কেলেটনের উপাদান এবং ইউক্যারিওটিক কোষে ব্যাপকভাবে সংরক্ষিত থাকে। টিউবুলিন হেটেরোডাইমার α-টিউবুলিন এবং β-টিউবুলিন দ্বারা গঠিত, যা রৈখিক মাইক্রোটিউবিউল প্রোটোফিলামেন্ট তৈরি করে, এবং এই ১৩টি প্রোটোফিলামেন্ট মিলে একটি নলাকার কাঠামো গঠন করে। উদ্ভিদ কোষে মাইক্রোটিউবিউল একাধিক ভূমিকা পালন করে, যার মধ্যে রয়েছে কোষের আকৃতি নির্ধারণ, কোষ বিভাজন এবং আন্তঃকোষীয় পরিবহন³,⁴। উদ্ভিদ কোষে ইন্টারফেজ প্লাজমা মেমব্রেনের নিচে মাইক্রোটিউবিউল থাকে, এবং এই তথাকথিত কর্টিক্যাল মাইক্রোটিউবিউলগুলো সেলুলোজ সিন্থেজ কমপ্লেক্সের নিয়ন্ত্রণের মাধ্যমে সেলুলোজ মাইক্রোফাইব্রিলের বিন্যাস নিয়ন্ত্রণ করে বলে মনে করা হয়⁴,⁵। মূলের অগ্রভাগের দ্রুত প্রসারণশীল অঞ্চলে অবস্থিত মূলের এপিডার্মাল কোষের কর্টিক্যাল মাইক্রোটিউবিউলগুলো পার্শ্বীয়ভাবে অবস্থান করে, এবং সেলুলোজ মাইক্রোফাইবারগুলো এই মাইক্রোটিউবিউলগুলোকে অনুসরণ করে কোষ প্রসারণের দিক সীমিত করে, যার ফলে অ্যানাইসোট্রপিক কোষ প্রসারণকে উৎসাহিত করে। অতএব, মাইক্রোটিউবিউলের কার্যকারিতা উদ্ভিদের অঙ্গসংস্থানের সাথে ঘনিষ্ঠভাবে সম্পর্কিত। টিউবুলিন এনকোডিংকারী জিনে অ্যামিনো অ্যাসিড প্রতিস্থাপনের ফলে অ্যারাবিডোপসিসে কর্টিকাল মাইক্রোটিউবিউল অ্যারের তির্যক বিন্যাস এবং বাম বা ডান দিকে বৃদ্ধি ঘটে 6,7। একইভাবে, মাইক্রোটিউবিউল ডায়নামিক্স নিয়ন্ত্রণকারী মাইক্রোটিউবিউল-সম্পর্কিত প্রোটিনের মিউটেশনও মূলের বিকৃত বৃদ্ধির কারণ হতে পারে 8,9,10,11,12,13। এছাড়াও, ডিসোপাইরামাইড, যা প্রিটিলাক্লোর নামেও পরিচিত, এর মতো মাইক্রোটিউবিউল-বিঘ্নকারী হার্বিসাইড দিয়ে চিকিৎসার ফলেও বাম দিকে তির্যক মূলের বৃদ্ধি ঘটে 14। এই তথ্যগুলো ইঙ্গিত দেয় যে উদ্ভিদের বৃদ্ধির দিক নির্ধারণের জন্য মাইক্রোটিউবিউলের কার্যাবলীর সুনির্দিষ্ট নিয়ন্ত্রণ অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ।
বিভিন্ন ধরণের মাইক্রোটিউবিউল ইনহিবিটর আবিষ্কৃত হয়েছে, এবং এই ওষুধগুলি সাইটোস্কেলেটাল গবেষণার পাশাপাশি কৃষি ও চিকিৎসাবিদ্যায় উল্লেখযোগ্য অবদান রেখেছে। বিশেষ করে, অরাইজালিন, ডাইনাইট্রোঅ্যানিলিন যৌগ, ডিসোপাইরামাইড, বেনজামাইড-সম্পর্কিত যৌগ এবং তাদের অ্যানালগগুলি মাইক্রোটিউবিউলের কার্যকারিতা ব্যাহত করতে পারে এবং এর ফলে উদ্ভিদের বৃদ্ধি বাধা দেয়। তাই, এগুলি আগাছানাশক হিসেবে ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত হয়। তবে, যেহেতু মাইক্রোটিউবিউল উদ্ভিদ এবং প্রাণী কোষের একটি গুরুত্বপূর্ণ উপাদান, তাই বেশিরভাগ মাইক্রোটিউবিউল ইনহিবিটর উভয় ধরণের কোষের জন্যই বিষাক্ত। তাই, আগাছানাশক হিসেবে তাদের স্বীকৃত উপযোগিতা থাকা সত্ত্বেও, ব্যবহারিক উদ্দেশ্যে সীমিত সংখ্যক অ্যান্টিমাইক্রোটিউবিউল এজেন্ট ব্যবহৃত হয়।
স্ট্রেপ্টোমাইসিস হলো স্ট্রেপ্টোমাইসিস পরিবারের একটি গণ, যার মধ্যে বায়বীয়, গ্রাম-পজিটিভ, তন্তুময় ব্যাকটেরিয়া অন্তর্ভুক্ত এবং এটি বিভিন্ন ধরণের সেকেন্ডারি মেটাবোলাইট উৎপাদনের ক্ষমতার জন্য ব্যাপকভাবে পরিচিত। তাই, এটিকে নতুন জৈবিকভাবে সক্রিয় প্রাকৃতিক পণ্যের অন্যতম গুরুত্বপূর্ণ উৎস হিসেবে বিবেচনা করা হয়। বর্তমান গবেষণায়, আমরা কৌমামোনামাইড নামক একটি নতুন যৌগ আবিষ্কার করেছি, যা স্ট্রেপ্টোমাইসিস ওয়ারেনসিস MK493-CF1 এবং এস. ওয়ারেনসিস ISP 5486 থেকে পৃথক করা হয়েছিল। বর্ণালী বিশ্লেষণ এবং পূর্ণ বর্ণালী বিশ্লেষণের মাধ্যমে, কৌমামোনামাইডের গঠন বৈশিষ্ট্য নির্ধারণ করা হয়েছিল এবং এর অনন্য এন-অ্যালকক্সিপাইরোল কঙ্কাল নির্ণয় করা হয়েছিল। সংশ্লেষণ। আরসমোনিক অ্যাসিড, যা আরসমনোঅ্যামাইড এবং এর ডেরিভেটিভগুলির একটি সিন্থেটিক মধ্যবর্তী যৌগ, জনপ্রিয় মডেল উদ্ভিদ অ্যারাবিডোপসিস থ্যালিয়ানা-র বৃদ্ধি এবং অঙ্কুরোদগমকে বাধা দেয় বলে দেখা গেছে। একটি গঠন-কার্যকারিতা সম্পর্ক গবেষণায় আমরা দেখতে পেয়েছি যে, উরসোনিক অ্যাসিডের C9 পরিবর্তিত একটি যৌগ, যা উরসোনিক অ্যাসিডের ননাইলঅক্সি ডেরিভেটিভ (KAND) নামে পরিচিত, বৃদ্ধি ও অঙ্কুরোদগমের উপর এর প্রতিরোধমূলক প্রভাবকে উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি করে। লক্ষণীয়ভাবে, এই নব আবিষ্কৃত উদ্ভিদ বৃদ্ধি প্রতিরোধকটি তামাক এবং লিভারওয়ার্টের বৃদ্ধিকেও প্রভাবিত করেছিল এবং এটি ব্যাকটেরিয়া বা HeLa কোষের জন্য বিষাক্ত ছিল না। অধিকন্তু, কিছু উরমোটোনিক অ্যাসিড ডেরিভেটিভ মূলের বিকৃত ফিনোটাইপ তৈরি করে, যা ইঙ্গিত দেয় যে এই ডেরিভেটিভগুলি প্রত্যক্ষ বা পরোক্ষভাবে মাইক্রোটিউবিউলকে প্রভাবিত করে। এই ধারণার সাথে সঙ্গতি রেখে, ইমিউনোহিস্টোকেমিক্যালি বা ফ্লুরোসেন্ট প্রোটিন দ্বারা চিহ্নিত মাইক্রোটিউবিউলের উপর আমাদের পর্যবেক্ষণ ইঙ্গিত দেয় যে KAND প্রয়োগ মাইক্রোটিউবিউলের ডিপলিমারাইজেশন ঘটায়। এছাড়াও, কুমামোটোনিক অ্যাসিড ডেরিভেটিভের প্রয়োগ অ্যাকটিন মাইক্রোফিলামেন্টকে ব্যাহত করে। সুতরাং, আমরা একটি নতুন উদ্ভিদ বৃদ্ধি প্রতিরোধক আবিষ্কার করেছি যার অনন্য কার্যপ্রণালীর মধ্যে সাইটোস্কেলেটন ধ্বংস করা জড়িত।
MK493-CF1 স্ট্রেইনটি টোকিওর শিনাগাওয়া-কু-এর মাটি থেকে পৃথক করা হয়েছিল। MK493-CF1 স্ট্রেইনটি সুশাখাযুক্ত স্ট্রোমাল মাইসেলিয়াম গঠন করে। এর 16S রাইবোসোমাল আরএনএ জিনের (1422 bp) আংশিক অনুক্রম নির্ণয় করা হয়েছিল। এই স্ট্রেইনটি S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: টিপিক্যাল স্ট্রেইন, 99.93%) এর সাথে খুবই সাদৃশ্যপূর্ণ। এই ফলাফলের উপর ভিত্তি করে, এটি নির্ধারণ করা হয়েছিল যে এই স্ট্রেইনটি S. werraensis-এর টাইপ স্ট্রেইনের সাথে ঘনিষ্ঠভাবে সম্পর্কিত। অতএব, আমরা সাময়িকভাবে এই স্ট্রেইনটির নাম দিয়েছি S. werraensis MK493-CF1। S. werraensis ISP 5486T-ও একই জৈব-সক্রিয় যৌগ উৎপাদন করে। যেহেতু এই অণুজীব থেকে প্রাকৃতিক পণ্য আহরণের বিষয়ে প্রাথমিক গবেষণা খুব কম ছিল, তাই আরও রাসায়নিক গবেষণা চালানো হয়েছিল। ৩০°C তাপমাত্রায় ১৪ দিন ধরে বার্লি মাধ্যমে সলিড-স্টেট ফারমেন্টেশন পদ্ধতিতে S. werraensis MK493-CF1 চাষ করার পর, মাধ্যমটিকে ৫০% EtOH দিয়ে নিষ্কাশন করা হয়েছিল। ৬০ মিলি নমুনা শুকিয়ে ৫৯.৫ মিলিগ্রাম অপরিশোধিত নির্যাস পাওয়া যায়। অপরিশোধিত নির্যাসটিকে রিভার্স ফেজ HPLC-এর মাধ্যমে বিশ্লেষণ করে N-মিথক্সি-1H-পাইরোল-2-কার্বক্সামাইড (১, যার নাম কুমামোনামাইড, ৩৬.০ মিলিগ্রাম) পাওয়া যায়। ১-এর মোট পরিমাণ অপরিশোধিত নির্যাসের প্রায় ৬০%। অতএব, আমরা কুমামোনামাইড ১-এর বৈশিষ্ট্যগুলো বিস্তারিতভাবে অধ্যয়ন করার সিদ্ধান্ত নিয়েছি।
কুমামোনামাইড ১ একটি সাদা অনিয়তাকার পাউডার এবং উচ্চ রেজোলিউশন ভর বর্ণালিবীক্ষণ (HRESIMS) C6H8N2O2 নিশ্চিত করে (চিত্র ১)। এই যৌগের C2-প্রতিস্থাপিত পাইরোল খণ্ডটি δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, 1H NMR বর্ণালীতে δH: 4.5 Hz, H-5) এবং δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6) দ্বারা চিহ্নিত করা হয়, এবং 13C NMR বর্ণালী চারটি sp2 কার্বন পরমাণুর উপস্থিতি দেখায়। C2 অবস্থানে একটি অ্যামাইড গ্রুপের উপস্থিতি C-3 প্রোটন থেকে δC 161.1-এ অবস্থিত অ্যামাইড কার্বনিল কার্বনের সাথে HMBC কোরিলেশনের মাধ্যমে মূল্যায়ন করা হয়েছিল। এছাড়াও, δH 4.10 (3H, S) এবং δC 68.3-এ 1H এবং 13C NMR পিকগুলো অণুতে N-মিথক্সি গ্রুপের উপস্থিতি নির্দেশ করে। যদিও এনহ্যান্সড ডিফারেন্স স্পেকট্রোস্কোপি এবং নিউক্লিয়ার ওভারহাউজার অ্যাব্রিভিয়েশন (NOEDF)-এর মতো স্পেকট্রোস্কোপিক বিশ্লেষণের মাধ্যমে মিথক্সি গ্রুপের সঠিক অবস্থান এখনও নির্ধারণ করা হয়নি, N-মিথক্সি-1H-পাইরোল-2-কার্বক্সামাইড প্রথম সম্ভাব্য যৌগ হিসেবে বিবেচিত হয়।
১-এর সঠিক গঠন নির্ধারণের জন্য, একটি সম্পূর্ণ সংশ্লেষণ করা হয়েছিল (চিত্র ২ক)। বাণিজ্যিকভাবে উপলব্ধ ২-অ্যামিনোপাইরিডিন ২-কে m-CPBA দিয়ে ট্রিটমেন্ট করার ফলে পরিমাণগত ফলনে সংশ্লিষ্ট N-অক্সাইড ৩ পাওয়া যায়। ২-এর ২-অ্যামিনোঅ্যাজিডেশনের পর, আব্রামোভিচ বর্ণিত সাইক্লোকন্ডেনসেশন বিক্রিয়াটি বেনজিনে ৯০°C তাপমাত্রায় সম্পন্ন করা হয়, যার ফলে কাঙ্ক্ষিত ১-হাইড্রক্সি-১H-পাইরোল-২-কার্বনাইট্রাইল ৫ গ্রাম পরিমাণে পাওয়া যায়। গতি ৬০% (দুই ধাপে)। ১৫,১৬। এরপর ৪-এর মিথাইলেশন এবং হাইড্রোলাইসিসের মাধ্যমে ১-মিথক্সি-১H-পাইরোল-২-কার্বক্সিলিক অ্যাসিড (যাকে “কুমামোটোনিক অ্যাসিড” বলা হয়, ৬) ভালো ফলনে (৭০%, দুই ধাপে) পাওয়া যায়। অবশেষে, অ্যাসিড ক্লোরাইড ইন্টারমিডিয়েট ৬ ব্যবহার করে জলীয় অ্যামোনিয়া দিয়ে অ্যামিডেশন করার ফলে ৯৮% ফলনে কুমামোটো অ্যামাইড ১ পাওয়া যায়। সংশ্লেষিত 1-এর সমস্ত বর্ণালী উপাত্ত বিচ্ছিন্ন 1-এর অনুরূপ ছিল, ফলে 1-এর গঠন নির্ণয় করা হয়েছিল;
আরবেনামাইড এবং আরবেনিক অ্যাসিডের সাধারণ সংশ্লেষণ এবং জৈবিক ক্রিয়াকলাপের বিশ্লেষণ। (ক) কুমামোটো অ্যামাইডের সম্পূর্ণ সংশ্লেষণ। (খ) সাত দিন বয়সী ওয়াইল্ড-টাইপ অ্যারাবিডোপসিস কলাম্বিয়া (Col) চারাকে নির্দেশিত ঘনত্বে কুমামোনামাইড ৬ বা কুমামোনামাইড ১ যুক্ত মুরাশিগে ও স্কুগ (MS) প্লেটে জন্মানো হয়েছিল। স্কেল বার = ১ সেমি।
প্রথমে, আমরা উদ্ভিদের বৃদ্ধি নিয়ন্ত্রণ করার ক্ষমতার জন্য আরবেনামাইড এবং এর মধ্যবর্তী যৌগগুলোর জৈবিক কার্যকলাপ মূল্যায়ন করেছি। আমরা MS অ্যাগার মাধ্যমে আর্সমোনামাইড ১ বা আর্সমোনিক অ্যাসিড ৬-এর বিভিন্ন ঘনত্ব যোগ করে এই মাধ্যমে অ্যারাবিডোপসিস থ্যালিয়ানা চারাগাছের চাষ করেছি। এই পরীক্ষাগুলো দেখিয়েছে যে ৬-এর উচ্চ ঘনত্ব (৫০০ μM) মূলের বৃদ্ধিকে বাধা দেয় (চিত্র ২খ)। এরপর, আমরা ৬-এর N1 অবস্থানে প্রতিস্থাপন করে বিভিন্ন ডেরিভেটিভ তৈরি করেছি এবং সেগুলোর উপর গঠন-কার্যকারিতা সম্পর্কীয় গবেষণা পরিচালনা করেছি (অ্যানালগ সংশ্লেষণ প্রক্রিয়াটি সাপোর্টিং ইনফরমেশন (SI)-তে বর্ণনা করা হয়েছে)। অ্যারাবিডোপসিস চারাগাছগুলোকে ৫০ μM আর্সোনিক অ্যাসিড ডেরিভেটিভযুক্ত একটি মাধ্যমে বড় করা হয়েছিল এবং মূলের দৈর্ঘ্য পরিমাপ করা হয়েছিল, যেমনটি ছবিতে দেখানো হয়েছে। চিত্র 3a, b, এবং S1-এ যেমন দেখানো হয়েছে, কুমামো অ্যাসিডগুলির N1 অবস্থানে বিভিন্ন দৈর্ঘ্যের রৈখিক অ্যালকক্সি শৃঙ্খল (9, 10, 11, 12, এবং 13) অথবা বৃহৎ অ্যালকক্সি শৃঙ্খল (15, 16, এবং 17) রয়েছে। এই ডেরিভেটিভগুলি মূলের বৃদ্ধিতে উল্লেখযোগ্য বাধা সৃষ্টি করে। এছাড়াও, আমরা দেখতে পেয়েছি যে 200 μM 10, 11, বা 17 প্রয়োগ করলে অঙ্কুরোদগম ব্যাহত হয় (চিত্র 3c এবং S2)।
কুমামোটো অ্যামাইড এবং সম্পর্কিত যৌগসমূহের গঠন-কার্যকারিতা সম্পর্ক অধ্যয়ন। (ক) অ্যানালগগুলির গঠন এবং সংশ্লেষণ পরিকল্পনা। (খ) ৫০ μM কুমামোনামাইড ডেরিভেটিভ সহ বা ছাড়া MS মাধ্যমে জন্মানো ৭-দিন বয়সী চারাগাছের মূলের দৈর্ঘ্যের পরিমাণ নির্ধারণ। তারকাচিহ্নগুলি শ্যাম ট্রিটমেন্টের সাথে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য নির্দেশ করে (টি টেস্ট, p < ০.০৫)।< ০.০৫)। n>১৮. উপাত্ত গড় ± এসডি (SD) হিসাবে দেখানো হয়েছে। nt মানে “পরীক্ষা করা হয়নি” কারণ ৫০% এর বেশি বীজ অঙ্কুরিত হয়নি। (গ) ২০০ μM কুমামোনামাইড এবং সম্পর্কিত যৌগসহ বা ছাড়া এমএস (MS) মাধ্যমে ৭ দিন ধরে ইনকিউবেট করা শোধিত বীজের অঙ্কুরোদগম হারের পরিমাণ নির্ণয়। তারকাচিহ্নগুলি শ্যাম ট্রিটমেন্টের (sham treatment) সাথে তাৎপর্যপূর্ণ পার্থক্য নির্দেশ করে (কাই-স্কয়ার পরীক্ষা)। n=৯৬।
মজার ব্যাপার হলো, C9-এর চেয়ে দীর্ঘ অ্যালকাইল পার্শ্ব শৃঙ্খল যুক্ত করলে প্রতিরোধমূলক কার্যকলাপ হ্রাস পায়, যা থেকে বোঝা যায় যে কুমামোটোয়িক অ্যাসিড-সম্পর্কিত যৌগগুলির জৈবিক কার্যকলাপ প্রদর্শনের জন্য একটি নির্দিষ্ট আকারের পার্শ্ব শৃঙ্খলের প্রয়োজন হয়।
যেহেতু গঠন-কার্যকারিতা সম্পর্ক বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে C9 পরিবর্তিত হয়ে আরসোনিক অ্যাসিডে পরিণত হয়েছে এবং আরসোনিক অ্যাসিডের ননাইলক্সি ডেরিভেটিভ (যা পরবর্তীতে KAND 11 হিসাবে উল্লেখিত) উদ্ভিদের বৃদ্ধি রোধের ক্ষেত্রে সবচেয়ে কার্যকর, তাই আমরা KAND 11-এর আরও বিশদ বৈশিষ্ট্য নিরূপণ করেছি। ৫০ μM KAND 11 দিয়ে অ্যারাবিডোপসিসকে ট্রিটমেন্ট করলে অঙ্কুরোদগম প্রায় সম্পূর্ণরূপে বন্ধ হয়ে যায়, যেখানে KAND 11-এর কম ঘনত্ব (৪০, ৩০, ২০, বা ১০ μM) মাত্রা-নির্ভর পদ্ধতিতে মূলের বৃদ্ধিকে বাধা দেয় (চিত্র ৪ক, খ)। KAND 11 মূলের মেরিস্টেমের কার্যকারিতাকে প্রভাবিত করে কিনা তা পরীক্ষা করার জন্য, আমরা প্রোপিডিয়াম আয়োডাইড (PI) দিয়ে রঞ্জিত মূলের মেরিস্টেম পরীক্ষা করেছি এবং মেরিস্টেমের ক্ষেত্রফল পরিমাপ করেছি। ২৫ μM KAND-11 যুক্ত মাধ্যমে জন্মানো চারাগাছের মেরিস্টেমের আকার ছিল ১৫১.১ ± ৩২.৫ μm, যেখানে DMSO যুক্ত কন্ট্রোল মাধ্যমে জন্মানো চারাগাছের মেরিস্টেমের আকার ছিল ২৬৪.৭ ± ৩০.৮ μm (চিত্র ৪গ, ঘ), যা নির্দেশ করে যে KAND-11 কোষীয় কার্যকলাপ পুনরুদ্ধার করে। মূল মেরিস্টেম। এর সাথে সামঞ্জস্য রেখে, KAND 11 প্রয়োগ মূল মেরিস্টেমে কোষ বিভাজন মার্কার CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS সংকেতের পরিমাণ হ্রাস করে (চিত্র ৪ঙ)¹⁷। এই ফলাফলগুলি নির্দেশ করে যে KAND 11 কোষ বিভাজন কার্যকলাপ হ্রাস করার মাধ্যমে মূলের বৃদ্ধিকে বাধা দেয়।
বৃদ্ধির উপর আরবেনোনিক অ্যাসিড ডেরিভেটিভস (আরবেনাইলোক্সি ডেরিভেটিভস)-এর বাধাদানকারী প্রভাবের বিশ্লেষণ। (ক) MS প্লেটে KAND 11-এর নির্দেশিত ঘনত্ব সহ জন্মানো ৭-দিন বয়সী ওয়াইল্ড-টাইপ Col চারা। স্কেল বার = ১ সেমি। (খ) মূলের দৈর্ঘ্যের পরিমাণ নির্ধারণ। অক্ষরগুলি তাৎপর্যপূর্ণ পার্থক্য নির্দেশ করে (Tukey HSD পরীক্ষা, p < 0.05)।< ০.০৫)। n>১৬. ডেটা গড় ± এসডি (SD) হিসাবে দেখানো হয়েছে। (গ) ২৫ μM KAND 11 সহ বা ছাড়া MS প্লেটে জন্মানো প্রোপিডিয়াম আয়োডাইড-রঞ্জিত ওয়াইল্ড-টাইপ Col মূলের কনফোকাল মাইক্রোস্কোপি। সাদা বন্ধনী মূল মেরিস্টেম নির্দেশ করে। স্কেল বার = ১০০ µm। (ঘ) মূল মেরিস্টেমের আকারের পরিমাণ নির্ধারণ (n = ১০ থেকে ১১)। টি-টেস্ট (p < ০.০৫) ব্যবহার করে পরিসংখ্যানগত পার্থক্য নির্ধারণ করা হয়েছিল।< ০.০৫)। বারগুলো গড় মেরিস্টেমের আকার নির্দেশ করে। (ঙ) CDKB2 কনস্ট্রাক্ট ধারণকারী একটি মূল মেরিস্টেমের ডিফারেনশিয়াল ইন্টারফেরেন্স কনট্রাস্ট (DIC) মাইক্রোস্কোপি; 1pro: CDKB2; 1-GUS স্টেইন করা এবং MS প্লেটে ২৫ µM KAND অ্যাসে সহ বা ছাড়া জন্মানো ৫-দিন বয়সী চারাগাছের উপর স্টেইন করা।
KAND 11-এর উদ্ভিদবিষাক্ততা আরও একটি দ্বিবীজপত্রী উদ্ভিদ, তামাক (Nicotiana tabacum), এবং একটি প্রধান স্থলজ উদ্ভিদ মডেল জীব, লিভারওয়ার্ট (Marchantia polymorpha) ব্যবহার করে পরীক্ষা করা হয়েছিল। অ্যারাবিডোপসিসের মতো, 25 μM KAND 11 যুক্ত মাধ্যমে জন্মানো তামাক SR-1 চারাগাছের শিকড় ছোট হয়েছিল (চিত্র 5a)। উপরন্তু, 200 μM KAND 11 যুক্ত প্লেটে 48টি বীজের মধ্যে 40টি অঙ্কুরিত হয়েছিল, যেখানে মক-ট্রিটেড মাধ্যমে 48টি বীজের সবগুলোই অঙ্কুরিত হয়েছিল, যা নির্দেশ করে যে KAND-এর উচ্চতর ঘনত্ব তাৎপর্যপূর্ণ ছিল (p < 0.05)।< ০.০৫; কাই-স্কয়ার পরীক্ষা) তামাকের অঙ্কুরোদগমকে বাধা দেয়। (চিত্র ৫খ)। এছাড়াও, লিভারওয়ার্টে ব্যাকটেরিয়ার বৃদ্ধিকে বাধা দেয় এমন KAND 11-এর ঘনত্ব অ্যারাবিডোপসিসের কার্যকর ঘনত্বের অনুরূপ ছিল (চিত্র ৫গ)। এই ফলাফলগুলি ইঙ্গিত দেয় যে KAND 11 বিভিন্ন ধরণের উদ্ভিদের বৃদ্ধিকে বাধা দিতে পারে। এরপর আমরা অন্যান্য জীবে, যথা উচ্চতর প্রাণী এবং ব্যাকটেরিয়া কোষের প্রতিনিধি হিসাবে যথাক্রমে মানব HeLa কোষ এবং Escherichia coli স্ট্রেইন DH5α-তে, বেয়ার মনোঅ্যামাইড-সম্পর্কিত যৌগগুলির সম্ভাব্য কোষবিষাক্ততা পরীক্ষা করি। ধারাবাহিক কোষ বৃদ্ধি পরীক্ষায়, আমরা লক্ষ্য করেছি যে কুমামোনামাইড ১, কুমামোনামাইডিক অ্যাসিড ৬, এবং KAND 11 ১০০ μM ঘনত্বে HeLa বা E. coli কোষের বৃদ্ধিকে প্রভাবিত করেনি (চিত্র ৫ঘ,ঙ)।
নন-অ্যারাবিডোপসিস জীবে KAND 11 দ্বারা বৃদ্ধি বাধা। (ক) দুই সপ্তাহ বয়সী ওয়াইল্ড-টাইপ SR-1 তামাকের চারাকে ২৫ μM KAND 11 যুক্ত উল্লম্বভাবে স্থাপিত MS প্লেটে জন্মানো হয়েছিল। (খ) দুই সপ্তাহ বয়সী ওয়াইল্ড-টাইপ SR-1 তামাকের চারাকে ২০০ μM KAND 11 যুক্ত অনুভূমিকভাবে স্থাপিত MS প্লেটে জন্মানো হয়েছিল। (গ) দুই সপ্তাহ বয়সী ওয়াইল্ড-টাইপ Tak-1 লিভারওয়ার্টের কুঁড়িকে KAND 11-এর নির্দেশিত ঘনত্বসহ Gamborg B5 প্লেটে জন্মানো হয়েছিল। লাল তীরচিহ্নগুলো সেই স্পোরগুলোকে নির্দেশ করে যেগুলো দুই সপ্তাহের ইনকিউবেশন পিরিয়ডের মধ্যে বৃদ্ধি বন্ধ করে দিয়েছে। (ঘ) HeLa কোষের কোষ বিভাজন পরীক্ষা। একটি সেল কাউন্টিং কিট ৮ (ডোজিন্ডো) ব্যবহার করে নির্দিষ্ট সময় অন্তর সজীব কোষের সংখ্যা পরিমাপ করা হয়েছিল। নিয়ন্ত্রক হিসেবে, HeLa কোষগুলোকে ৫ μg/ml অ্যাক্টিনোমাইসিন ডি (Act D) দিয়ে ট্রিট করা হয়েছিল, যা RNA পলিমারেজ ট্রান্সক্রিপশনকে বাধা দেয় এবং কোষের মৃত্যু ঘটায়। বিশ্লেষণগুলো তিনবার করে করা হয়েছিল। (ঙ) ই. কোলাই কোষের সংখ্যাবৃদ্ধি পরীক্ষা। OD600 পরিমাপের মাধ্যমে ই. কোলাই-এর বৃদ্ধি বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। নিয়ন্ত্রক হিসেবে, কোষগুলোকে ৫০ μg/ml অ্যাম্পিসিলিন (Amp) দিয়ে শোধন করা হয়েছিল, যা ব্যাকটেরিয়ার কোষ প্রাচীর সংশ্লেষণকে বাধা দেয়। বিশ্লেষণগুলো তিনবার করে করা হয়েছিল।
ইউরামাইড-সম্পর্কিত যৌগ দ্বারা সৃষ্ট সাইটোটক্সিসিটির কার্যপ্রণালী বোঝার জন্য, আমরা মাঝারি প্রতিরোধমূলক প্রভাব সহ আরবেনিক অ্যাসিড ডেরিভেটিভগুলি পুনরায় বিশ্লেষণ করেছি, যেমনটি ছবিতে দেখানো হয়েছে। চিত্র 2b, 6a-তে যেমন দেখানো হয়েছে, উচ্চ ঘনত্বের (200 μM) আরমোটোনিক অ্যাসিড 6 যুক্ত অ্যাগার প্লেটে জন্মানো চারাগাছগুলির শিকড় ছোট এবং বাম দিকে বাঁকা (θ = – 23.7 ± 6.1) ছিল, যেখানে কন্ট্রোল মিডিয়ামে জন্মানো চারাগাছগুলির শিকড় প্রায় সোজা (θ = – 3.8 ± 7.1) ছিল। এই বৈশিষ্ট্যপূর্ণ তির্যক বৃদ্ধি কর্টিক্যাল মাইক্রোটিউবিউলের অকার্যকারিতার ফলে ঘটে বলে জানা যায়¹⁴,¹⁸। এই ফলাফলের সাথে সামঞ্জস্য রেখে, মাইক্রোটিউবিউল-অস্থিতিশীলকারী ওষুধ ডিসোপাইরামাইড এবং অরাইজালিন আমাদের বৃদ্ধির পরিস্থিতিতে একই রকম শিকড়ের হেলে যাওয়া প্ররোচিত করেছে (চিত্র 2b, 6a)। একই সময়ে, আমরা উরমোটোনিক অ্যাসিড ডেরিভেটিভ পরীক্ষা করে দেখেছি এবং সেগুলোর মধ্যে থেকে এমন কয়েকটি নির্বাচন করেছি যেগুলো নির্দিষ্ট ঘনত্বে তির্যক মূল বৃদ্ধি ঘটায়। যৌগ ৮, ৯, এবং ১৫ যথাক্রমে ৭৫ μM, ৫০ μM, এবং ৪০ μM ঘনত্বে মূল বৃদ্ধির দিক পরিবর্তন করে, যা নির্দেশ করে যে এই যৌগগুলো কার্যকরভাবে মাইক্রোটিউবিউলকে অস্থিতিশীল করতে পারে (চিত্র ২খ, ৬ক)। আমরা সবচেয়ে শক্তিশালী উরসোলিক অ্যাসিড ডেরিভেটিভ, KAND 11, কম ঘনত্বে (১৫ µM) পরীক্ষা করে দেখেছি এবং দেখতে পেয়েছি যে KAND 11 প্রয়োগে মূল বৃদ্ধি ব্যাহত হয় এবং মূল বৃদ্ধির দিক অসম হয়, যদিও সেগুলো বাম দিকে ঢালু হওয়ার প্রবণতা দেখায় (চিত্র C3)। যেহেতু মাইক্রোটিউবিউল-অস্থিতিশীলকারী ওষুধের উচ্চ ঘনত্ব কখনও কখনও মূলের হেলে পড়ার পরিবর্তে উদ্ভিদের বৃদ্ধি ব্যাহত করে, তাই আমরা পরবর্তীকালে মূলের এপিডার্মাল কোষে কর্টিক্যাল মাইক্রোটিউবিউল পর্যবেক্ষণ করে KAND 11 মাইক্রোটিউবিউলের উপর প্রভাব ফেলে কিনা সেই সম্ভাবনাটি মূল্যায়ন করেছি। ২৫ μM KAND 11 দ্বারা শোধিত চারাগাছের মূলের এপিডার্মাল কোষে অ্যান্টি-β-টিউবুলিন অ্যান্টিবডি ব্যবহার করে ইমিউনোহিস্টোকেমিস্ট্রি পরীক্ষায় দেখা গেছে যে, প্রসারণ অঞ্চলের এপিডার্মাল কোষগুলিতে প্রায় সমস্ত কর্টিক্যাল মাইক্রোটিউবিউল অদৃশ্য হয়ে গেছে (চিত্র ৬খ)। এই ফলাফলগুলি ইঙ্গিত দেয় যে কুমামোটোনিক অ্যাসিড এবং এর ডেরিভেটিভগুলি মাইক্রোটিউবিউলের উপর প্রত্যক্ষ বা পরোক্ষভাবে কাজ করে সেগুলিকে ব্যাহত করে এবং এই যৌগগুলি হলো নতুন ধরনের মাইক্রোটিউবিউল ইনহিবিটর।
আর্সোনিক অ্যাসিড এবং এর ডেরিভেটিভসমূহ অ্যারাবিডোপসিস থ্যালিয়ানা উদ্ভিদের কর্টিক্যাল মাইক্রোটিউবিউল পরিবর্তন করে। (ক) নির্দেশিত ঘনত্বে বিভিন্ন আর্সোনিক অ্যাসিড ডেরিভেটিভের উপস্থিতিতে পরিমাপকৃত মূলের আনতি কোণ। মাইক্রোটিউবিউলকে বাধা দেয় বলে পরিচিত দুটি যৌগ: ডিসোপাইরামাইড এবং অরাইজালিনের প্রভাবও বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। ইনসেটে মূলের বৃদ্ধির কোণ পরিমাপের জন্য ব্যবহৃত স্ট্যান্ডার্ড দেখানো হয়েছে। তারকাচিহ্নগুলি শ্যাম ট্রিটমেন্টের সাথে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য নির্দেশ করে (টি টেস্ট, পি < ০.০৫)।< ০.০৫)। n>১৯. স্কেল বার = ১ সেমি। (খ) প্রসারণ অঞ্চলের এপিডার্মাল কোষের কর্টিক্যাল মাইক্রোটিউবিউল। ২৫ μM KAND 11 সহ বা ছাড়া MS প্লেটে জন্মানো ওয়াইল্ড-টাইপ অ্যারাবিডোপসিস কল মূলের মাইক্রোটিউবিউলগুলো β-টিউবুলিন প্রাইমারি অ্যান্টিবডি এবং অ্যালেক্সা ফ্লুর-সংযুক্ত সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি ব্যবহার করে ইমিউনোহিস্টোকেমিক্যাল স্টেইনিং দ্বারা দৃশ্যমান করা হয়েছিল। স্কেল বার = ১০ µm। (গ) মূল মেরিস্টেমের মাইক্রোটিউবিউলের মাইটোটিক গঠন। ইমিউনোহিস্টোকেমিক্যাল স্টেইনিং ব্যবহার করে মাইক্রোটিউবিউলগুলো দৃশ্যমান করা হয়েছিল। প্রোফেজ জোন, স্পিন্ডল এবং ফ্র্যাগমোপ্লাস্ট সহ মাইটোটিক গঠনগুলো কনফোকাল চিত্র থেকে গণনা করা হয়েছিল। তীরচিহ্নগুলো মাইটোটিক মাইক্রোটিউবিউল গঠন নির্দেশ করে। তারকাচিহ্নগুলো শ্যাম ট্রিটমেন্টের সাথে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য নির্দেশ করে (টি টেস্ট, p < ০.০৫)।< ০.০৫)। n>৯. স্কেল বার = ৫০ মাইক্রোমিটার।
যদিও Ursa-র মাইক্রোটিউবিউলের কার্যকারিতা ব্যাহত করার ক্ষমতা আছে, এর কার্যপ্রণালী সাধারণ মাইক্রোটিউবিউল ডিপলিমারাইজিং এজেন্টগুলোর থেকে ভিন্ন হবে বলে আশা করা যায়। উদাহরণস্বরূপ, ডিসোপাইরামাইড এবং অরাইজালিনের মতো মাইক্রোটিউবিউল ডিপলিমারাইজিং এজেন্টগুলোর উচ্চ ঘনত্ব এপিডার্মাল কোষের অ্যানাইসোট্রপিক প্রসারণ ঘটায়, যেখানে KAND 11 তা করে না। এছাড়াও, KAND 11 এবং ডিসোপাইরামাইডের সহ-প্রয়োগের ফলে ডিসোপাইরামাইড-প্ররোচিত মূল বৃদ্ধির প্রতিক্রিয়া এবং KAND 11-প্ররোচিত বৃদ্ধি প্রতিবন্ধকতার একটি সম্মিলিত প্রভাব পরিলক্ষিত হয়েছে (চিত্র S4)। আমরা KAND 11-এর প্রতি অতিসংবেদনশীল ডিসোপাইরামাইড 1-1 (phs1-1) মিউট্যান্টের প্রতিক্রিয়াও বিশ্লেষণ করেছি। phs1-1-এর একটি নন-ক্যানোনিকাল টিউবুলিন কাইনেজ পয়েন্ট মিউটেশন রয়েছে এবং ডিসোপাইরামাইড দিয়ে ট্রিটমেন্ট করলে এটি খাটো মূল তৈরি করে৯,২০। KAND 11 যুক্ত অ্যাগার মাধ্যমে জন্মানো phs1-1 মিউট্যান্ট চারাগাছের মূলগুলো ডিসোপাইরামাইডে জন্মানো চারাগাছের মূলের মতোই খাটো ছিল (চিত্র S5)।
এছাড়াও, KAND 11 দ্বারা শোধিত চারাগাছের মূল মেরিস্টেমে আমরা মাইটোটিক মাইক্রোটিউবিউল কাঠামো, যেমন প্রোফেজ জোন, স্পিন্ডল এবং ফ্র্যাগমোপ্লাস্ট পর্যবেক্ষণ করেছি। CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS-এর পর্যবেক্ষণের সাথে সামঞ্জস্য রেখে, মাইটোটিক মাইক্রোটিউবিউলের সংখ্যায় একটি উল্লেখযোগ্য হ্রাস পরিলক্ষিত হয়েছে (চিত্র .6c)।
সাবসেলুলার রেজোলিউশনে KAND 11-এর সাইটোটক্সিসিটি চিহ্নিত করার জন্য, আমরা তামাকের BY-2 সাসপেনশন কোষগুলিকে KAND 11 দিয়ে ট্রিট করেছি এবং তাদের প্রতিক্রিয়া পর্যবেক্ষণ করেছি। কর্টিক্যাল মাইক্রোটিউবিউলের উপর KAND 11-এর প্রভাব মূল্যায়ন করার জন্য, আমরা প্রথমে TagRFP-TUA6 প্রকাশকারী BY-2 কোষে KAND 11 যোগ করেছি, যা মাইক্রোটিউবিউলগুলিকে ফ্লুরোসেন্টভাবে লেবেল করে। কর্টিক্যাল মাইক্রোটিউবিউলের ঘনত্ব ইমেজ বিশ্লেষণের মাধ্যমে মূল্যায়ন করা হয়েছিল, যা সাইটোপ্লাজমিক পিক্সেলের মধ্যে সাইটোস্কেলেটাল পিক্সেলের শতাংশ পরিমাপ করে। পরীক্ষার ফলাফল দেখায় যে, ১ ঘন্টা ধরে ৫০ μM বা ১০০ μM KAND 11 দিয়ে ট্রিটমেন্ট করার পর, ঘনত্ব উল্লেখযোগ্যভাবে কমে যথাক্রমে ০.৯৪ ± ০.৭৪% বা ০.২৩ ± ০.২৮% হয়েছে, যেখানে DMSO দিয়ে ট্রিটমেন্ট করা কোষের ঘনত্ব ছিল ১.৬১ ± ০.৩৪% (চিত্র ৭ক)। এই ফলাফলগুলো অ্যারাবিডোপসিসে করা পর্যবেক্ষণের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, যেখানে দেখা গেছে যে KAND 11 প্রয়োগ কর্টিক্যাল মাইক্রোটিউবিউলের ডিপলিমারাইজেশন ঘটায় (চিত্র ৬খ)। আমরা একই ঘনত্বের KAND 11 দিয়ে প্রয়োগের পর GFP-ABD-লেবেলযুক্ত অ্যাকটিন ফিলামেন্টসহ BY-2 লাইনটিও পরীক্ষা করে দেখেছি এবং লক্ষ্য করেছি যে KAND 11 প্রয়োগ অ্যাকটিন ফিলামেন্টগুলোকে ভেঙে দিয়েছে। ১ ঘণ্টা ধরে ৫০ μM বা ১০০ μM KAND 11 দিয়ে প্রয়োগ অ্যাকটিন ফিলামেন্টের ঘনত্বকে উল্লেখযোগ্যভাবে কমিয়ে যথাক্রমে ১.২০ ± ০.৬২% বা ০.৬১ ± ০.২৬%-এ নামিয়ে এনেছে, যেখানে DMSO-প্রয়োগকৃত কোষগুলোতে এই ঘনত্ব ছিল ১.৬৯ ± ০.৫১% (চিত্র ২, ৭খ)। এই ফলাফলগুলো প্রোপিজামাইডের প্রভাবের বিপরীত, যা অ্যাকটিন ফিলামেন্টকে প্রভাবিত করে না, এবং ল্যাট্রাঙ্কুলিন বি-এরও বিপরীত, যা একটি অ্যাকটিন ডিপলিমারাইজার হওয়া সত্ত্বেও মাইক্রোটিউবিউলকে প্রভাবিত করে না (পরিশিষ্ট চিত্র S6)। এছাড়াও, কুমামোনামাইড ১, কুমামোনামাইড অ্যাসিড ৬, বা KAND 11 দিয়ে চিকিৎসা HeLa কোষের মাইক্রোটিউবিউলকে প্রভাবিত করেনি (SI চিত্র S7)। সুতরাং, KAND 11-এর কার্যপ্রণালী পরিচিত সাইটোস্কেলেটন বিঘ্নকারীগুলোর থেকে ভিন্ন বলে মনে করা হয়। এছাড়াও, KAND 11 দিয়ে চিকিৎসা করা BY-2 কোষের উপর আমাদের আণুবীক্ষণিক পর্যবেক্ষণে KAND 11 চিকিৎসার সময় কোষ মৃত্যুর সূত্রপাত দেখা গেছে এবং দেখা গেছে যে KAND 11 চিকিৎসার ৩০ মিনিট পর ইভান্স ব্লু-রঞ্জিত মৃত কোষের অনুপাত উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পায়নি, যেখানে ৫০ μM বা ১০০ μM KAND দিয়ে ৯০ মিনিট চিকিৎসার পর মৃত কোষের সংখ্যা যথাক্রমে ৪৩.৭% বা ৮০.১% বৃদ্ধি পেয়েছে (চিত্র 7c)। সব মিলিয়ে, এই তথ্যগুলো নির্দেশ করে যে নতুন আর্সোলিক অ্যাসিড ডেরিভেটিভ KAND 11 হলো একটি উদ্ভিদ-নির্দিষ্ট সাইটোস্কেলেটাল ইনহিবিটর যার কার্যপ্রণালী পূর্বে অজানা ছিল।
KAND তামাক BY-2 কোষের কর্টিকাল মাইক্রোটিউবিউল, অ্যাকটিন ফিলামেন্ট এবং কার্যক্ষমতাকে প্রভাবিত করে। (ক) TagRFP-TUA6-এর উপস্থিতিতে BY-2 কোষে কর্টিকাল মাইক্রোটিউবিউলের দৃশ্যায়ন। KAND 11 (৫০ μM বা ১০০ μM) অথবা DMSO দ্বারা ট্রিট করা BY-2 কোষগুলোকে কনফোকাল মাইক্রোস্কোপি দ্বারা পরীক্ষা করা হয়েছিল। ২৫টি স্বতন্ত্র কোষের মাইক্রোগ্রাফ থেকে কর্টিকাল মাইক্রোটিউবিউলের ঘনত্ব গণনা করা হয়েছিল। অক্ষরগুলো তাৎপর্যপূর্ণ পার্থক্য নির্দেশ করে (Tukey HSD পরীক্ষা, p < ০.০৫)।< ০.০৫)। স্কেল বার = ১০ µm। (খ) GFP-ABD2-এর উপস্থিতিতে BY-2 কোষের কর্টিক্যাল অ্যাকটিন ফিলামেন্টসমূহ দৃশ্যমান করা হয়েছে। KAND 11 (৫০ μM বা ১০০ μM) অথবা DMSO দ্বারা ট্রিট করা BY-2 কোষগুলোকে কনফোকাল মাইক্রোস্কোপি দ্বারা পরীক্ষা করা হয়েছিল। ২৫টি স্বতন্ত্র কোষের মাইক্রোগ্রাফ থেকে কর্টিক্যাল অ্যাকটিন ফিলামেন্টের ঘনত্ব গণনা করা হয়েছিল। অক্ষরগুলো তাৎপর্যপূর্ণ পার্থক্য নির্দেশ করে (Tukey HSD পরীক্ষা, p < ০.০৫)।< ০.০৫)। স্কেল বার = ১০ µm। (গ) ইভান্স ব্লু স্টেইনিং দ্বারা মৃত BY-2 কোষ পর্যবেক্ষণ। KAND 11 (৫০ μM বা ১০০ μM) অথবা DMSO দ্বারা ট্রিট করা BY-2 কোষগুলোকে ব্রাইট-ফিল্ড মাইক্রোস্কোপি দ্বারা পরীক্ষা করা হয়েছিল। n=৩। স্কেল বার = ১০০ µm।
নতুন প্রাকৃতিক পণ্যের আবিষ্কার ও প্রয়োগ চিকিৎসা ও কৃষিসহ মানব জীবনের বিভিন্ন ক্ষেত্রে উল্লেখযোগ্য অগ্রগতি এনেছে। প্রাকৃতিক সম্পদ থেকে উপকারী যৌগ আহরণের জন্য ঐতিহাসিক গবেষণা পরিচালিত হয়েছে। বিশেষ করে, অ্যাক্টিনোমাইসিটিস নেমাটোডের জন্য পরজীবী-বিরোধী অ্যান্টিবায়োটিক হিসেবে উপকারী বলে পরিচিত, কারণ এদের অ্যাভারমেকটিন (আইভারমেকটিনের প্রধান যৌগ) এবং ব্লিওমাইসিন ও এর ডেরিভেটিভের মতো বিভিন্ন সেকেন্ডারি মেটাবোলাইট উৎপাদনের ক্ষমতা রয়েছে, যা ঔষধিগতভাবে ক্যান্সার-বিরোধী এজেন্ট হিসেবে ব্যবহৃত হয়। একইভাবে, অ্যাক্টিনোমাইসিটিস থেকে বিভিন্ন ধরনের আগাছানাশক যৌগ আবিষ্কৃত হয়েছে, যার মধ্যে কিছু ইতোমধ্যে বাণিজ্যিকভাবে ব্যবহৃত হচ্ছে। অতএব, কাঙ্ক্ষিত জৈবিক ক্রিয়াকলাপ সম্পন্ন প্রাকৃতিক পণ্য পৃথক করার জন্য অ্যাক্টিনোমাইসিটিস মেটাবোলাইটের বিশ্লেষণকে একটি কার্যকর কৌশল হিসেবে বিবেচনা করা হয়। এই গবেষণায়, আমরা S. werraensis থেকে একটি নতুন যৌগ, কৌমামোনামাইড, আবিষ্কার করেছি এবং সফলভাবে এটি সংশ্লেষণ করেছি। আরসোনিক অ্যাসিড হলো আরবেনামাইড এবং এর ডেরিভেটিভের একটি সংশ্লেষিত মধ্যবর্তী যৌগ। এটি গাছের মূলকে বৈশিষ্ট্যপূর্ণভাবে কুঁচকে দিতে পারে, মাঝারি থেকে তীব্র আগাছানাশক কার্যকারিতা প্রদর্শন করতে পারে এবং প্রত্যক্ষ বা পরোক্ষভাবে উদ্ভিদের মাইক্রোটিউবিউলকে ক্ষতিগ্রস্ত করতে পারে। তবে, উরমোটোনিক অ্যাসিডের কার্যপ্রণালী বিদ্যমান মাইক্রোটিউবিউল ইনহিবিটরগুলোর থেকে ভিন্ন হতে পারে, যেহেতু KAND 11 অ্যাকটিন ফিলামেন্টকেও ব্যাহত করে এবং কোষের মৃত্যু ঘটায়, যা এমন একটি নিয়ন্ত্রক পদ্ধতির ইঙ্গিত দেয় যার মাধ্যমে উরমোটোনিক অ্যাসিড এবং এর ডেরিভেটিভগুলো বিস্তৃত পরিসরের সাইটোস্কেলেটাল কাঠামোকে প্রভাবিত করে।
আর্বেনোনিক অ্যাসিডের আরও বিশদ বৈশিষ্ট্য নিরূপণ এর কার্যপ্রণালী আরও ভালোভাবে বুঝতে সাহায্য করবে। বিশেষ করে, পরবর্তী লক্ষ্য হলো হ্রাসপ্রাপ্ত মাইক্রোটিউবিউলের সাথে আর্বেনোনিক অ্যাসিডের আবদ্ধ হওয়ার ক্ষমতা মূল্যায়ন করা, যাতে এটি নির্ধারণ করা যায় যে আর্বেনোনিক অ্যাসিড এবং এর ডেরিভেটিভগুলো সরাসরি মাইক্রোটিউবিউলের উপর কাজ করে সেগুলোকে ডিপলিমারাইজ করে, নাকি তাদের ক্রিয়ার ফলে মাইক্রোটিউবিউল অস্থিতিশীল হয়ে পড়ে। এছাড়াও, যেসব ক্ষেত্রে মাইক্রোটিউবিউল সরাসরি লক্ষ্যবস্তু নয়, সেসব ক্ষেত্রে উদ্ভিদ কোষে আর্বেনোনিক অ্যাসিডের ক্রিয়াস্থল এবং আণবিক লক্ষ্যবস্তু শনাক্ত করা সম্পর্কিত যৌগগুলোর বৈশিষ্ট্য এবং আগাছানাশক কার্যকারিতা উন্নত করার সম্ভাব্য উপায়গুলো আরও ভালোভাবে বুঝতে সাহায্য করবে। আমাদের জৈব-কার্যকারিতা পরীক্ষাটি অ্যারাবিডোপসিস থ্যালিয়ানা, তামাক এবং লিভারওয়ার্টের মতো উদ্ভিদের বৃদ্ধির উপর আর্বেনোনিক অ্যাসিডের অনন্য কোষবিষাক্ত ক্ষমতা প্রকাশ করেছে, যেখানে ই. কোলাই বা হেলা কোষের উপর এর কোনো প্রভাব পড়েনি। প্রাণী কোষের প্রতি সামান্য বা কোনো বিষাক্ততা না থাকাটা আর্বেনোনিক অ্যাসিড ডেরিভেটিভগুলোর একটি সুবিধা, যদি এগুলোকে উন্মুক্ত কৃষি জমিতে ব্যবহারের জন্য আগাছানাশক হিসেবে তৈরি করা হয়। প্রকৃতপক্ষে, যেহেতু মাইক্রোটিউবিউল ইউক্যারিওটদের মধ্যে একটি সাধারণ কাঠামো, তাই উদ্ভিদে এদের নির্বাচনী বাধা প্রদান হার্বিসাইডের জন্য একটি মূল প্রয়োজনীয়তা। উদাহরণস্বরূপ, প্রোপিজামাইড, একটি মাইক্রোটিউবিউল ডিপলিমারাইজিং এজেন্ট যা সরাসরি টিউবুলিনের সাথে আবদ্ধ হয় এবং পলিমারাইজেশনকে বাধা দেয়, প্রাণী কোষের প্রতি এর কম বিষাক্ততার কারণে হার্বিসাইড হিসাবে ব্যবহৃত হয়। ডিসোপিরামাইডের বিপরীতে, সম্পর্কিত বেনজামাইডগুলির বিভিন্ন লক্ষ্যবস্তু নির্দিষ্টতা রয়েছে। উদ্ভিদের মাইক্রোটিউবিউল ছাড়াও, RH-4032 বা বেনজোক্সামাইড যথাক্রমে প্রাণী কোষ বা উমাইসিটের মাইক্রোটিউবিউলকেও বাধা দেয় এবং জালিলামাইড এর কম ফাইটোবিষাক্ততার কারণে ছত্রাকনাশক হিসাবে ব্যবহৃত হয়। নতুন আবিষ্কৃত বিয়ার এবং এর ডেরিভেটিভগুলি উদ্ভিদের বিরুদ্ধে নির্বাচনী সাইটোটক্সিসিটি প্রদর্শন করে, তবে এটি লক্ষণীয় যে আরও পরিবর্তন তাদের লক্ষ্যবস্তু নির্দিষ্টতা পরিবর্তন করতে পারে, যা সম্ভাব্যভাবে রোগ সৃষ্টিকারী ছত্রাক বা উমাইসিট নিয়ন্ত্রণের জন্য অতিরিক্ত ডেরিভেটিভ সরবরাহ করতে পারে।
আরবেনোনিক অ্যাসিড এবং এর ডেরিভেটিভগুলির অনন্য বৈশিষ্ট্যগুলি হার্বিসাইড হিসাবে তাদের বিকাশ এবং গবেষণার উপকরণ হিসাবে ব্যবহারের জন্য উপযোগী। উদ্ভিদ কোষের আকৃতি নিয়ন্ত্রণে সাইটোস্কেলেটনের গুরুত্ব ব্যাপকভাবে স্বীকৃত। পূর্ববর্তী গবেষণায় দেখা গেছে যে উদ্ভিদ সঠিকভাবে মরফোজেনেসিস নিয়ন্ত্রণের জন্য মাইক্রোটিউবিউলের গতিশীলতা নিয়ন্ত্রণের মাধ্যমে কর্টিক্যাল মাইক্রোটিউবিউল সংগঠনের জটিল প্রক্রিয়া বিকশিত করেছে। মাইক্রোটিউবিউলের কার্যকলাপ নিয়ন্ত্রণের জন্য দায়ী বিপুল সংখ্যক অণু শনাক্ত করা হয়েছে এবং এ সম্পর্কিত গবেষণা এখনও চলছে৩,৪,২৮। উদ্ভিদ কোষে মাইক্রোটিউবিউলের গতিশীলতা সম্পর্কে আমাদের বর্তমান ধারণা কর্টিক্যাল মাইক্রোটিউবিউল সংগঠনের প্রক্রিয়াগুলিকে সম্পূর্ণরূপে ব্যাখ্যা করে না। উদাহরণস্বরূপ, যদিও ডিসোপাইরামাইড এবং অরাইজালিন উভয়ই মাইক্রোটিউবিউলকে ডিপলিমারাইজ করতে পারে, ডিসোপাইরামাইড মূলে মারাত্মক বিকৃতি ঘটায়, যেখানে অরাইজালিনের প্রভাব তুলনামূলকভাবে মৃদু। অধিকন্তু, টিউবুলিনের মিউটেশন, যা মাইক্রোটিউবিউলকে স্থিতিশীল করে, মূলে ডেক্সট্রোরোটেশন ঘটায়, যেখানে প্যাকলিট্যাক্সেল, যা মাইক্রোটিউবিউলের গতিশীলতাকেও স্থিতিশীল করে, তা ঘটায় না। অতএব, আরসোলিক অ্যাসিডের আণবিক লক্ষ্যবস্তু অধ্যয়ন এবং শনাক্তকরণ উদ্ভিদের কর্টিক্যাল মাইক্রোটিউবিউলের নিয়ন্ত্রণ সম্পর্কে নতুন অন্তর্দৃষ্টি প্রদান করবে। একইভাবে, ভবিষ্যতে ডিসোপাইরামাইডের মতো বিকৃত বৃদ্ধি ঘটাতে কার্যকর রাসায়নিক এবং অরাইজালিন বা কুমামোটোরিক অ্যাসিডের মতো কম কার্যকর রাসায়নিকের মধ্যে তুলনা করলে, এই বিকৃত বৃদ্ধি কীভাবে ঘটে সে সম্পর্কে সূত্র পাওয়া যাবে।
অন্যদিকে, উরসোনিক অ্যাসিডের কোষবিষাক্ততা ব্যাখ্যা করার জন্য প্রতিরক্ষা-সম্পর্কিত সাইটোস্কেলেটাল পুনর্বিন্যাস আরেকটি সম্ভাবনা। উদ্ভিদ কোষে রোগজীবাণুর সংক্রমণ বা উদ্দীপকের প্রবেশ কখনও কখনও সাইটোস্কেলেটনের ধ্বংস এবং পরবর্তীকালে কোষের মৃত্যু ঘটায়²⁹। উদাহরণস্বরূপ, উমাইসিট-উদ্ভূত ক্রিপ্টোক্সান্থিন তামাক কোষের মৃত্যুর পূর্বে মাইক্রোটিউবিউল এবং অ্যাক্টিন ফিলামেন্টকে ব্যাহত করে বলে জানা গেছে, যা KAND চিকিৎসার ক্ষেত্রেও ঘটে থাকে³⁰,³¹। প্রতিরক্ষা প্রতিক্রিয়া এবং উরসোনিক অ্যাসিড দ্বারা প্ররোচিত কোষীয় প্রতিক্রিয়ার মধ্যেকার সাদৃশ্য আমাদের এই অনুমানে উপনীত করেছে যে, তারা সাধারণ কোষীয় প্রক্রিয়াকে উদ্দীপ্ত করে, যদিও ক্রিপ্টোক্সান্থিনের তুলনায় উরসোনিক অ্যাসিডের দ্রুততর এবং শক্তিশালী প্রভাব সুস্পষ্ট। তবে, গবেষণায় দেখা গেছে যে অ্যাক্টিন ফিলামেন্টের ব্যাহতকরণ স্বতঃস্ফূর্ত কোষের মৃত্যুকে উৎসাহিত করে, যার সাথে সবসময় মাইক্রোটিউবিউলের ব্যাহতকরণ ঘটে না²⁹। এছাড়াও, রোগজীবাণু বা উদ্দীপক উরসোনিক অ্যাসিড ডেরিভেটিভের মতো মূলের বিকৃত বৃদ্ধি ঘটায় কিনা, তা এখনও দেখার বিষয়। সুতরাং, প্রতিরক্ষা প্রতিক্রিয়া এবং সাইটোস্কেলেটনের মধ্যে সংযোগ স্থাপনকারী আণবিক জ্ঞান একটি আকর্ষণীয় সমস্যা যা সমাধান করা প্রয়োজন। আর্সোনিক অ্যাসিডের সাথে সম্পর্কিত কম আণবিক ওজনের যৌগ এবং বিভিন্ন ক্ষমতাসম্পন্ন এর নানা ডেরিভেটিভের উপস্থিতি কাজে লাগিয়ে, তারা অজানা কোষীয় কার্যপ্রণালীকে লক্ষ্যবস্তু করার সুযোগ তৈরি করতে পারেন।
সামগ্রিকভাবে, মাইক্রোটিউবিউলের গতিশীলতা নিয়ন্ত্রণকারী নতুন যৌগসমূহের আবিষ্কার ও প্রয়োগ উদ্ভিদ কোষের আকৃতি নির্ধারণের অন্তর্নিহিত জটিল আণবিক প্রক্রিয়াগুলো অনুধাবনের জন্য শক্তিশালী পদ্ধতি প্রদান করবে। এই প্রেক্ষাপটে, সম্প্রতি আবিষ্কৃত যৌগ আরমেনোনিক অ্যাসিড, যা মাইক্রোটিউবিউল ও অ্যাকটিন ফিলামেন্টকে প্রভাবিত করে এবং কোষের মৃত্যু ঘটায়, তা মাইক্রোটিউবিউল নিয়ন্ত্রণ এবং এই অন্যান্য প্রক্রিয়াগুলোর মধ্যকার সংযোগ উদ্ঘাটনের একটি সুযোগ তৈরি করতে পারে। সুতরাং, আরমেনোনিক অ্যাসিড ব্যবহার করে রাসায়নিক ও জৈবিক বিশ্লেষণ আমাদের উদ্ভিদের সাইটোস্কেলেটন নিয়ন্ত্রণকারী আণবিক নিয়ন্ত্রক প্রক্রিয়াগুলো বুঝতে সাহায্য করবে।
একটি ৫০০ মিলি ব্যাফেলড আর্লেনমেয়ার ফ্লাস্কে ১১০ মিলি সীড মিডিয়াম নিয়ে তাতে S. werraensis MK493-CF1 ইনোকুলেট করুন। এই সীড মিডিয়ামে রয়েছে ২% (w/v) গ্যালাকটোজ, ২% (w/v) এসেন্স পেস্ট, ১% (w/v) ব্যাক্টো কম্পোজিশন - সয়াটন (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক, ইনকর্পোরেটেড), ০.৫% (w/v) কর্ন এক্সট্র্যাক্ট (কোগোশ্চ কোং, লিমিটেড, জাপান), ০.২% (w/v) (NH4)2SO4 এবং ০.২% CaCO3 যা ডিআয়োনাইজড জলে দ্রবীভূত। (জীবাণুমুক্তকরণের আগে pH ৭.৪)। সীড কালচারগুলিকে একটি রোটারি শেকারে (১৮০ rpm) ২৭°C তাপমাত্রায় ২ দিনের জন্য ইনকিউবেট করা হয়েছিল। সলিড স্টেট ফারমেন্টেশন পদ্ধতির মাধ্যমে উৎপাদন চাষ। বীজ কালচার (৭ মিলি) একটি ৫০০ মিলি কে-১ ফ্লাস্কে স্থানান্তর করা হয়েছিল, যেখানে ৪০ গ্রাম উৎপাদন মাধ্যম ছিল। এই মাধ্যমটি ১৫ গ্রাম চাপানো বার্লি (মুসো কোং, লিমিটেড, জাপান) এবং ২৫ গ্রাম ডিআয়োনাইজড পানি (জীবাণুমুক্তকরণের আগে পিএইচ সামঞ্জস্য করা হয়নি) দিয়ে গঠিত ছিল। ফারমেন্টেশন প্রক্রিয়াটি ৩০° সেলসিয়াস তাপমাত্রায় অন্ধকারে ১৪ দিন ধরে চালানো হয়েছিল। ফারমেন্টেশন উপাদানটি প্রতি বোতলে ৪০ মিলি ইথানল (EtOH) দিয়ে নিষ্কাশন করা হয়েছিল এবং সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল (১৫০০ গ্রাম, ৪° সেলসিয়াস, ১০ মিনিট)। কালচার সুপারন্যাট্যান্ট (৬০ মিলি) ১০% মিথানল (MeOH)/ইথাইল অ্যাসিটেট (EtOAc)-এর মিশ্রণ দিয়ে নিষ্কাশন করা হয়েছিল। জৈব স্তরটিকে হ্রাসকৃত চাপে বাষ্পীভূত করে একটি অবশেষ (৫৯.৫ মিলিগ্রাম) পাওয়া যায়, যেটিকে একটি রিভার্স ফেজ কলামে (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, ৫ মাইক্রোমিটার, অভ্যন্তরীণ ব্যাস ১০ মিমি × দৈর্ঘ্য ২৫০ মিমি) ১.৫ মিলি/মিনিট প্রবাহ হারে গ্রেডিয়েন্ট এলুশন (০–১০ মিনিট: ৯০%) সহ HPLC-এর অধীন করা হয়। এলুশন প্রক্রিয়াটি ছিল H2O/CH3CN, ১০–৩৫ মিনিট: ৯০% H2O/CH3CN থেকে ৭০% H2O/CH3CN (গ্রেডিয়েন্ট), ৩৫–৪৫ মিনিট: ৯০% H2O/EtOH, ৪৫–১৫৫ মিনিট: ৯০% H2O/EtOH থেকে ১০০% EtOH (গ্রেডিয়েন্ট), ১৫৫–২০০ মিনিট: ১০০% EtOH। এর ফলে কৌমামোনামাইড (১, ৩৬.০ মিলিগ্রাম) একটি সাদা অনিয়তাকার পাউডার হিসাবে পৃথক করা হয়।
কুমামোটোঅ্যামাইড(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t , J = 3.8 Hz, 1H). ), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ গণনাকৃত মান: 141.0659, পরিমাপকৃত মান: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1।
গবেষণার জন্য ব্যবহারের অনুমতিসহ অ্যারাবিডোপসিস বায়োলজিক্যাল রিসোর্স সেন্টার (ABRC) থেকে কলাম্বিয়া বীজ (Col-0) সংগ্রহ করা হয়েছিল। Col-0 বীজ আমাদের পরীক্ষাগারের পরিবেশে বংশবৃদ্ধি ও রক্ষণাবেক্ষণ করা হয়েছিল এবং ওয়াইল্ড-টাইপ অ্যারাবিডোপসিস উদ্ভিদ হিসেবে ব্যবহৃত হয়েছিল। অ্যারাবিডোপসিস বীজের উপরিভাগ জীবাণুমুক্ত করে অর্ধ-শক্তিসম্পন্ন মুরাশিগে ও স্কুগ মাধ্যমে চাষ করা হয়েছিল, যে মাধ্যমে ২% সুক্রোজ (ফুজিফিল্ম ওয়াকো পিওর কেমিক্যাল), ০.০৫% (w/v) ২-(৪-মরফোলিনো)ইথেনসালফোনিক অ্যাসিড (MES) (ফুজিফিল্ম ওয়াকো পিওর কেমিক্যাল) এবং ১.৫% অ্যাগার (ফুজিফিল্ম ওয়াকো পিওর কেমিক্যাল) ছিল। মাধ্যমটির pH ছিল ৫.৭ এবং এটি ২৩° সেলসিয়াস তাপমাত্রায় ও অবিরাম আলোতে রাখা হয়েছিল। phs1-1 মিউট্যান্টের বীজ টি. হাশিমোতো (নারা ইনস্টিটিউট অফ সায়েন্স অ্যান্ড টেকনোলজি) সরবরাহ করেছিলেন।
এসআর-১ স্ট্রেইনের বীজ টি. হাশিমোতো (নারা ইনস্টিটিউট অফ সায়েন্স অ্যান্ড টেকনোলজি) সরবরাহ করেছিলেন এবং এগুলোকে ওয়াইল্ড-টাইপ তামাক গাছ হিসেবে ব্যবহার করা হয়েছিল। অঙ্কুরোদগম ত্বরান্বিত করার জন্য তামাকের বীজের উপরিভাগ জীবাণুমুক্ত করে তিন রাত জীবাণুমুক্ত জলে ভিজিয়ে রাখা হয়েছিল। এরপর সেগুলোকে ২% সুক্রোজ, ০.০৫% (ওজন/আয়তন) এমইএস, এবং ০.৮% জেলান গাম (ফুজিফিল্ম ওয়াকো পিওর কেমিক্যাল) যুক্ত একটি অর্ধ-শক্তিশালী দ্রবণে (মুরাশিগে এবং স্কুগ মিডিয়াম) পিএইচ ৫.৭-এ রেখে ২৩° সেলসিয়াস তাপমাত্রায় অবিরাম আলোর নিচে ইনকিউবেট করা হয়েছিল।
টাক-১ স্ট্রেইনটি টি. কোহচি (কিয়োটো বিশ্ববিদ্যালয়) কর্তৃক সরবরাহ করা হয়েছিল এবং লিভারওয়ার্ট গবেষণার জন্য আদর্শ পরীক্ষামূলক একক হিসেবে ব্যবহৃত হয়েছিল। জীবাণুমুক্ত চাষ করা উদ্ভিদ থেকে জেমা সংগ্রহ করে ১% সুক্রোজ ও ০.৩% জেলান গামযুক্ত গ্যামবর্গ বি৫ মিডিয়ামে (ফুজিফিল্ম ওয়াকো পিওর কেমিক্যাল) প্লেটিং করা হয় এবং অবিচ্ছিন্ন আলোর অধীনে ২৩° সেলসিয়াস তাপমাত্রায় ইনকিউবেট করা হয়।
তামাক BY-2 কোষ (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) এস. হাসেজাওয়া (টোকিও বিশ্ববিদ্যালয়) দ্বারা সরবরাহ করা হয়েছিল। BY-2 কোষগুলিকে পরিবর্তিত লিন্সমেয়ার এবং স্কুগ মাধ্যমে ৯৫-গুণ পাতলা করা হয়েছিল এবং সাপ্তাহিক ভিত্তিতে ২,৪-ডাইক্লোরোফেনোক্সিঅ্যাসেটিক অ্যাসিড ৩২ যোগ করা হয়েছিল। কোষ সাসপেনশনটি অন্ধকারে ২৭°C তাপমাত্রায় একটি রোটারি শেকারে ১৩০ rpm গতিতে মেশানো হয়েছিল। কোষগুলিকে ১০ গুণ তাজা মাধ্যম দিয়ে ধুয়ে একই মাধ্যমে পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল। ফুলকপি মোজাইক ভাইরাস 35S প্রোমোটারের অধীনে মাইক্রোটিউবিউল মার্কার TagRFP-TUA6 বা অ্যাকটিন ফিলামেন্ট মার্কার GFP-ABD2 স্থিতিশীলভাবে প্রকাশকারী BY-2 ট্রান্সজেনিক কোষ লাইনগুলি বর্ণিত পদ্ধতি অনুসারে তৈরি করা হয়েছিল। এই কোষ লাইনগুলিকে মূল BY-2 কোষ লাইনের জন্য ব্যবহৃত পদ্ধতির অনুরূপ পদ্ধতি ব্যবহার করে রক্ষণাবেক্ষণ এবং সিনক্রোনাইজ করা যেতে পারে।
HeLa কোষগুলোকে ৩৭°C তাপমাত্রার এবং ৫% CO2 যুক্ত ইনকিউবেটরে ডুলবেকো'স মডিফায়েড ঈগল'স মিডিয়াম (DMEM) (লাইফ টেকনোলজিস)-এ কালচার করা হয়েছিল, যার সাথে ১০% ফিটাল বোভাইন সিরাম, ১.২ ইউনিট/মিলি পেনিসিলিন এবং ১.২ মাইক্রোগ্রাম/মিলি স্ট্রেপ্টোমাইসিন যোগ করা হয়েছিল।
এই পাণ্ডুলিপিতে বর্ণিত সকল পরীক্ষা-নিরীক্ষা জাপানের জৈব-নিরাপত্তা বিধিমালা ও নির্দেশিকা অনুসারে সম্পাদিত হয়েছে।
যৌগগুলিকে ডাইমিথাইল সালফোক্সাইড (ডিএমএসও; ফুজিফিল্ম ওয়াকো পিওর কেমিক্যাল)-এ স্টক দ্রবণ হিসাবে দ্রবীভূত করা হয়েছিল এবং অ্যারাবিডোপসিস ও তামাকের জন্য এমএস মাধ্যমে অথবা লিভারওয়ার্টের জন্য গ্যামবর্গ বি৫ মাধ্যমে লঘু করা হয়েছিল। মূল বৃদ্ধি প্রতিবন্ধকতা পরীক্ষার জন্য, প্রতি প্লেটে ১০টিরও বেশি বীজ নির্দেশিত যৌগ বা ডিএমএসও যুক্ত অ্যাগার মাধ্যমে বপন করা হয়েছিল। বীজগুলিকে একটি গ্রোথ চেম্বারে ৭ দিনের জন্য ইনকিউবেট করা হয়েছিল। চারাগাছগুলির ছবি তোলা হয়েছিল এবং মূলের দৈর্ঘ্য পরিমাপ করা হয়েছিল। অ্যারাবিডোপসিস অঙ্কুরোদগম পরীক্ষার জন্য, প্রতি প্লেটে ৪৮টি বীজ ২০০ μM যৌগ বা ডিএমএসও যুক্ত অ্যাগার মাধ্যমে বপন করা হয়েছিল। অ্যারাবিডোপসিস বীজগুলিকে একটি গ্রোথ চেম্বারে বড় করা হয়েছিল এবং অঙ্কুরোদগমের ৭ দিন পর (dag) অঙ্কুরিত চারার সংখ্যা গণনা করা হয়েছিল। তামাক অঙ্কুরোদগম পরীক্ষার জন্য, প্রতি প্লেটে ২৪টি বীজ ২০০ μM KAND বা ডিএমএসও যুক্ত অ্যাগার মাধ্যমে বপন করা হয়েছিল। তামাক বীজগুলিকে একটি গ্রোথ চেম্বারে বড় করা হয়েছিল এবং ১৪ দিন পর অঙ্কুরিত চারার সংখ্যা গণনা করা হয়েছিল। লিভারওয়ার্ট বৃদ্ধি প্রতিবন্ধকতা পরীক্ষার জন্য, প্রতিটি প্লেট থেকে ৯টি ভ্রূণকে KAND বা DMSO-এর নির্দেশিত ঘনত্বযুক্ত অ্যাগার মাধ্যমে স্থাপন করে একটি গ্রোথ চেম্বারে ১৪ দিন ধরে ইনকিউবেট করা হয়েছিল।
মূল মেরিস্টেমের গঠন পর্যবেক্ষণের জন্য ৫ মিলিগ্রাম/মিলি প্রোপিডিয়াম আয়োডাইড (PI) দিয়ে রঞ্জিত চারাগাছ ব্যবহার করা হয়। লাইকা মাইক্রোসিস্টেমসের একটি টিসিএস এসপিই কনফোকাল লেজার স্ক্যানিং মাইক্রোস্কোপ ব্যবহার করে ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপির মাধ্যমে পিআই সংকেতগুলো পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল।
মালামি এবং বেনফে৩৬ দ্বারা বর্ণিত প্রোটোকল অনুসারে β-গ্লুকুরোনিডেজ (GUS) দিয়ে মূলের হিস্টোকেমিক্যাল স্টেইনিং করা হয়েছিল। চারাগাছগুলিকে সারারাত ৯০% অ্যাসিটোনে স্থির রাখা হয়েছিল, GUS বাফারে ০.৫ মিলিগ্রাম/মিলি ৫-ব্রোমো-৪-ক্লোরো-৩-ইন্ডোলিল-β-d-গ্লুকুরোনিক অ্যাসিড দিয়ে ১ ঘন্টা ধরে স্টেইন করা হয়েছিল এবং একটি হাইড্রেটেড ক্লোরালডিহাইড দ্রবণে (৮ গ্রাম ক্লোরাল হাইড্রেট, ২ মিলি জল এবং ১ মিলি গ্লিসারল) রাখা হয়েছিল এবং একটি অ্যাক্সিও ইমেজার এম১ মাইক্রোস্কোপ (কার্ল জাইস) ব্যবহার করে ডিফারেনশিয়াল ইন্টারফেরেন্স কনট্রাস্ট মাইক্রোস্কোপির মাধ্যমে পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল।
খাড়াভাবে রাখা প্লেটে জন্মানো ৭ দিন বয়সী চারাগাছের মূলের কোণ পরিমাপ করা হয়েছিল। ধাপ ৬-এ বর্ণিত পদ্ধতি অনুযায়ী অভিকর্ষ ভেক্টরের দিক থেকে মূলের কোণ পরিমাপ করুন।
বর্ণিত পদ্ধতি অনুসারে কর্টিকাল মাইক্রোটিউবিউলসের বিন্যাস পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল, তবে প্রোটোকল 37-এ সামান্য পরিবর্তন আনা হয়েছিল। অ্যান্টি-β-টিউবুলিন অ্যান্টিবডি (KMX-1, মার্ক মিলিপোর: MAB3408) এবং অ্যালেক্সা ফ্লুর 488-সংযুক্ত অ্যান্টি-মাউস IgG (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক: A32723) যথাক্রমে 1:1000 এবং 1:100 ডাইলুশনে প্রাইমারি এবং সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি হিসেবে ব্যবহার করা হয়েছিল। ফ্লুরোসেন্স ছবিগুলো একটি TCS SPE কনফোকাল লেজার স্ক্যানিং মাইক্রোস্কোপ (লাইকা মাইক্রোসিস্টেমস) ব্যবহার করে সংগ্রহ করা হয়েছিল। প্রস্তুতকারকের নির্দেশাবলী অনুসারে Z-স্ট্যাক ছবি সংগ্রহ করুন এবং সর্বোচ্চ তীব্রতার প্রজেকশন তৈরি করুন।
প্রস্তুতকারকের নির্দেশাবলী অনুসারে সেল কাউন্টিং কিট ৮ (ডোজিন্ডো) ব্যবহার করে হেলা কোষের বিস্তার পরীক্ষাটি সম্পন্ন করা হয়েছিল।
স্পেকট্রোফটোমিটার ব্যবহার করে ৬০০ nm (OD600) তরঙ্গদৈর্ঘ্যে কালচারে কোষের ঘনত্ব পরিমাপের মাধ্যমে E. coli DH5α-এর বৃদ্ধি বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।
একটি CSU-X1 কনফোকাল স্ক্যানিং ডিভাইস (ইয়োকোগাওয়া) এবং একটি sCMOS ক্যামেরা (জাইলা, অ্যান্ডোর টেকনোলজি) সজ্জিত একটি ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপ ব্যবহার করে ট্রান্সজেনিক BY-2 কোষের সাইটোস্কেলেটাল গঠন পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল। ইমেজ বিশ্লেষণের মাধ্যমে সাইটোস্কেলেটাল ঘনত্ব নির্ণয় করা হয়েছিল, যা ImageJ সফটওয়্যার ব্যবহার করে কনফোকাল ইমেজের সাইটোপ্লাজমিক পিক্সেলের মধ্যে সাইটোস্কেলেটাল পিক্সেলের শতাংশ পরিমাপ করে, যেমনটি ৩৮,৩৯ এ বর্ণিত হয়েছে।
BY-2 কোষে কোষের মৃত্যু শনাক্ত করার জন্য, কোষ সাসপেনশনের একটি অংশকে ঘরের তাপমাত্রায় ১০ মিনিটের জন্য ০.০৫% ইভান্স ব্লু-এর সাথে ইনকিউবেট করা হয়েছিল। মৃত কোষের নির্বাচনী ইভান্স ব্লু স্টেইনিং সজীব কোষ থেকে অক্ষত প্লাজমা মেমব্রেন দ্বারা রঞ্জকের বহিষ্করণের উপর নির্ভর করে। স্টেইন করা কোষগুলো একটি ব্রাইট-ফিল্ড মাইক্রোস্কোপ (BX53, Olympus) ব্যবহার করে পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল।
HeLa কোষগুলোকে 37°C তাপমাত্রা এবং 5% CO2 যুক্ত একটি আর্দ্র ইনকিউবেটরে 10% FBS সহ DMEM মাধ্যমে কালচার করা হয়েছিল। কোষগুলোকে 37°C তাপমাত্রায় 6 ঘন্টার জন্য 100 μM KAND 11, কুমামোনামিক অ্যাসিড 6, কুমামোনামাইড 1, 100 ng/ml কলসেমিড (Gibco), অথবা 100 ng/ml নোকোডমেজ (Sigma) দিয়ে ট্রিট করা হয়েছিল। কোষগুলোকে ঘরের তাপমাত্রায় 10 মিনিটের জন্য MetOH এবং তারপর 5 মিনিটের জন্য অ্যাসিটেট দিয়ে ফিক্স করা হয়েছিল। ফিক্স করা কোষগুলোকে 0.5% BSA/PBS-এ মিশ্রিত β-টিউবুলিন প্রাইমারি অ্যান্টিবডি (1D4A4, Proteintech: 66240-1) দিয়ে 2 ঘন্টা ইনকিউবেট করা হয়েছিল, TBST দিয়ে 3 বার ধোয়া হয়েছিল, এবং তারপর অ্যালেক্সা ফ্লুর গোট অ্যান্টিবডি দিয়ে 1 ঘন্টা ইনকিউবেট করা হয়েছিল। – মাউস IgG (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক: A11001) এবং 0.5% BSA/PBS-এ মিশ্রিত 15 ng/ml 4′,6-ডায়ামিডিনো-2-ফেনাইলিন্ডোল (DAPI)। TBST দিয়ে তিনবার ধোয়ার পর, রঞ্জিত কোষগুলো একটি Nikon Eclipse Ti-E ইনভার্টেড মাইক্রোস্কোপে পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল। MetaMorph সফটওয়্যার (মলিকিউলার ডিভাইসেস) ব্যবহার করে একটি কুলড হামামাৎসু ORCA-R2 CCD ক্যামেরার সাহায্যে ছবিগুলো তোলা হয়েছিল।
পোস্ট করার সময়: জুন-১৭-২০২৪
