পাইন গাছের নেমাটোড রোগের প্রবর্তক হিসেবে আয়োডিন এবং অ্যাভারমেকটিনের মূল্যায়ন

পাইন নেমাটোড হলো একটি কোয়ারেন্টাইন পরিযায়ী অন্তঃপরজীবী, যা পাইন বন বাস্তুতন্ত্রে মারাত্মক অর্থনৈতিক ক্ষতির কারণ হিসেবে পরিচিত। বর্তমান গবেষণায় পাইন নেমাটোডের বিরুদ্ধে হ্যালোজিনেটেড ইন্ডোলের নেমাটোড-নাশক কার্যকারিতা এবং এর কার্যপ্রণালী পর্যালোচনা করা হয়েছে। পাইন নেমাটোডের বিরুদ্ধে ৫-আইওডোইন্ডোল এবং অ্যাভারমেকটিনের (পজিটিভ কন্ট্রোল) নেমাটোড-নাশক কার্যকারিতা একই রকম এবং কম ঘনত্বে (১০ μg/mL) উচ্চ ছিল। ৫-আইওডোইন্ডোল প্রজনন ক্ষমতা, প্রজনন কার্যকলাপ, ভ্রূণ ও লার্ভার মৃত্যুহার এবং চলন আচরণ হ্রাস করে। অমেরুদণ্ডী-নির্দিষ্ট গ্লুটামেট-গেটেড ক্লোরাইড চ্যানেল রিসেপ্টরের সাথে লিগ্যান্ডের আণবিক মিথস্ক্রিয়া এই ধারণাকে সমর্থন করে যে, অ্যাভারমেকটিনের মতো ৫-আইওডোইন্ডোলও রিসেপ্টরের সক্রিয় স্থানে দৃঢ়ভাবে আবদ্ধ হয়। ৫-আইওডোইন্ডোল নেমাটোডের মধ্যে বিভিন্ন ফিনোটাইপিক বিকৃতিও প্ররোচিত করে, যার মধ্যে অস্বাভাবিক অঙ্গের পতন/সংকোচন এবং বর্ধিত ভ্যাকুওলাইজেশন অন্তর্ভুক্ত। এই ফলাফলগুলি থেকে বোঝা যায় যে নেমাটোডের মিথাইলেশন-জনিত মৃত্যুতে ভ্যাকুওলের একটি ভূমিকা থাকতে পারে। গুরুত্বপূর্ণভাবে, ৫-আইওডোইনডোল উভয় উদ্ভিদ প্রজাতির (বাঁধাকপি এবং মুলা) জন্য অবিষাক্ত ছিল। সুতরাং, এই গবেষণাটি প্রমাণ করে যে পরিবেশগত পরিস্থিতিতে আইওডোইনডোল প্রয়োগের মাধ্যমে পাইন উইল্ট রোগের ক্ষতি নিয়ন্ত্রণ করা যায়।
পাইন উড নেমাটোড (বার্সাফেলেনকাস জাইলোফাইলাস) পাইন উড নেমাটোড (পিডব্লিউএন) গোত্রের অন্তর্গত। এটি এক প্রকার পরিযায়ী অন্তঃপরজীবী নেমাটোড যা পাইন বন বাস্তুতন্ত্রে মারাত্মক পরিবেশগত ক্ষতিসাধন করে বলে পরিচিত¹। পাইন উড নেমাটোড দ্বারা সৃষ্ট পাইন উইল্ট রোগ (পিডব্লিউডি) এশিয়া ও ইউরোপসহ বিভিন্ন মহাদেশে একটি গুরুতর সমস্যা হয়ে উঠছে এবং উত্তর আমেরিকায় এই নেমাটোড বহিরাগত পাইন প্রজাতি ধ্বংস করে¹,²। পাইন গাছের অবনতি একটি বড় অর্থনৈতিক সমস্যা এবং এর বিশ্বব্যাপী ছড়িয়ে পড়ার সম্ভাবনা উদ্বেগজনক³। নিম্নলিখিত পাইন প্রজাতিগুলো এই নেমাটোড দ্বারা সবচেয়ে বেশি আক্রান্ত হয়: পিনাস ডেনসিফ্লোরা, পিনাস সিলভেস্ট্রিস, পিনাস থুনবার্জি, পিনাস কোরাইয়েনসিস, পিনাস থুনবার্জি এবং পিনাস রেডিয়েটা⁴। পাইন নেমাটোড একটি মারাত্মক রোগ যা সংক্রমণের কয়েক সপ্তাহ বা মাসের মধ্যেই পাইন গাছকে মেরে ফেলতে পারে। এছাড়াও, বিভিন্ন বাস্তুতন্ত্রে পাইন নেমাটোডের প্রাদুর্ভাব সাধারণ ঘটনা, ফলে স্থায়ী সংক্রমণ শৃঙ্খল প্রতিষ্ঠিত হয়েছে¹।
বার্সাফেলেনকাস জাইলোফাইলাস হলো একটি কোয়ারেন্টাইন উদ্ভিদ-পরজীবী নেমাটোড যা অ্যাফেলেনকোইডিয়া অধিপরিবার এবং ১০২.৫ ক্লেডের অন্তর্গত। এই নেমাটোড ছত্রাক খেয়ে জীবনধারণ করে এবং পাইন গাছের কাষ্ঠ কলায় বংশবৃদ্ধি করে। এটি চারটি ভিন্ন লার্ভা দশায় (L1, L2, L3, L4) এবং একটি পূর্ণাঙ্গ জীবে পরিণত হয়¹,⁶। খাদ্যাভাবের পরিস্থিতিতে, পাইন নেমাটোড একটি বিশেষায়িত লার্ভা দশায়—ডাউয়ার—প্রবেশ করে, যা তার বাহক—পাইন বার্ক বিটল (মনোচামাস অল্টারনেটাস)-কে পরজীবী হিসেবে আক্রমণ করে এবং সুস্থ পাইন গাছে স্থানান্তরিত হয়। সুস্থ পোষকদেহে, নেমাটোডগুলো দ্রুত উদ্ভিদের কলার মধ্য দিয়ে পরিভ্রমণ করে এবং প্যারেনকাইমা কোষ খেয়ে জীবনধারণ করে, যার ফলে সংক্রমণের এক বছরের মধ্যে বিভিন্ন ধরনের অতিসংবেদনশীল প্রতিক্রিয়া, পাইন গাছের নেতিয়ে পড়া এবং মৃত্যু ঘটে¹,⁷,⁸।
পাইন নেমাটোডের জৈবিক নিয়ন্ত্রণ দীর্ঘকাল ধরেই একটি চ্যালেঞ্জ, এবং এর জন্য বিংশ শতাব্দী থেকে সঙ্গরোধ ব্যবস্থা চালু রয়েছে। পাইন নেমাটোড নিয়ন্ত্রণের বর্তমান কৌশলগুলির মধ্যে প্রধানত রাসায়নিক পদ্ধতি অন্তর্ভুক্ত, যার মধ্যে রয়েছে কাঠে ধোঁয়া দেওয়া এবং গাছের কাণ্ডে নেমাটোডনাশক স্থাপন। সবচেয়ে বেশি ব্যবহৃত নেমাটোডনাশকগুলি হলো অ্যাভারমেকটিন এবং অ্যাভারমেকটিন বেনজোয়েট, যা অ্যাভারমেকটিন পরিবারের অন্তর্গত। এই ব্যয়বহুল রাসায়নিকগুলি অনেক নেমাটোড প্রজাতির বিরুদ্ধে অত্যন্ত কার্যকর এবং পরিবেশগতভাবে নিরাপদ বলে বিবেচিত হয়৯। তবে, এই নেমাটোডনাশকগুলির বারবার ব্যবহারের ফলে একটি নির্বাচনী চাপ তৈরি হওয়ার আশঙ্কা করা হয়, যা প্রায় নিশ্চিতভাবেই প্রতিরোধী পাইন নেমাটোডের উদ্ভব ঘটাবে, যেমনটি লেপটিনোটার্সা ডেসেমলাইনিয়াটা, প্লুটেলা জাইলোস্টেলা এবং ট্রাইকোস্ট্রংগাইলাস কলুব্রিফর্মিস ও অস্টারটেজিয়া সারকামসিন্টা নামক বেশ কিছু কীটপতঙ্গের ক্ষেত্রে দেখা গেছে, যারা ধীরে ধীরে অ্যাভারমেকটিনের বিরুদ্ধে প্রতিরোধ ক্ষমতা গড়ে তুলেছে১০,১১,১২। অতএব, পিভিডি নিয়ন্ত্রণের জন্য বিকল্প, সাশ্রয়ী এবং পরিবেশবান্ধব ব্যবস্থা খুঁজে বের করতে প্রতিরোধের ধরণগুলি নিয়মিতভাবে অধ্যয়ন করা এবং নেমাটিসাইডগুলি ক্রমাগত পরীক্ষা করা প্রয়োজন। সাম্প্রতিক দশকগুলিতে, বেশ কিছু লেখক নেমাটোড নিয়ন্ত্রণকারী এজেন্ট হিসাবে উদ্ভিদের নির্যাস, অপরিহার্য তেল এবং উদ্বায়ী পদার্থ ব্যবহারের প্রস্তাব করেছেন¹³,¹⁴,¹⁵,¹⁶।
আমরা সম্প্রতি ক্যানোরহাবডিটিস এলিগ্যান্সে (Caenorhabditis elegans) ইন্ডোলের (indole) নেমাটোড-নাশক ক্রিয়া প্রদর্শন করেছি, যা একটি আন্তঃকোষীয় এবং আন্তঃরাজ্য সংকেত অণু। ইন্ডোল অণুজীব বাস্তুশাস্ত্রে একটি বহুল প্রচলিত অন্তঃকোষীয় সংকেত, যা অণুজীবের শারীরবৃত্ত, রেণু গঠন, প্লাজমিড স্থিতিশীলতা, ঔষধ প্রতিরোধ ক্ষমতা, বায়োফিল্ম গঠন এবং রোগ সৃষ্টিকারী ক্ষমতাকে প্রভাবিত করে এমন অসংখ্য কাজ নিয়ন্ত্রণ করে। অন্যান্য রোগ সৃষ্টিকারী নেমাটোডের বিরুদ্ধে ইন্ডোল এবং এর ডেরিভেটিভগুলির ক্রিয়া নিয়ে গবেষণা করা হয়নি। এই গবেষণায়, আমরা পাইন নেমাটোডের বিরুদ্ধে ৩৪টি ইন্ডোলের নেমাটোড-নাশক ক্রিয়া পরীক্ষা করেছি এবং মাইক্রোস্কোপি, টাইম-ল্যাপস ফটোগ্রাফি এবং মলিকুলার ডকিং পরীক্ষার মাধ্যমে সবচেয়ে শক্তিশালী ৫-আইওডোইন্ডোলের কার্যপ্রণালী ব্যাখ্যা করেছি এবং একটি বীজ অঙ্কুরোদগম পরীক্ষার মাধ্যমে উদ্ভিদের উপর এর বিষাক্ত প্রভাব মূল্যায়ন করেছি।
পূর্বে রিপোর্ট করা হয়েছে যে ইন্ডোলের উচ্চ ঘনত্ব (>1.0 mM) নেমাটোডের উপর নেমাটোডনাশক প্রভাব ফেলে¹⁷। B. xylophilus (মিশ্র জীবন পর্যায়)-কে 1 mM ঘনত্বে ইন্ডোল বা 33টি ভিন্ন ইন্ডোল ডেরিভেটিভ দিয়ে চিকিৎসা করার পর, নিয়ন্ত্রণ এবং চিকিৎসাকৃত গ্রুপে জীবিত ও মৃত নেমাটোড গণনা করে B. xylophilus-এর মৃত্যুহার পরিমাপ করা হয়েছিল। পাঁচটি ইন্ডোল উল্লেখযোগ্য নেমাটোডনাশক কার্যকলাপ প্রদর্শন করেছে; 24 ঘন্টা পরে চিকিৎসাবিহীন নিয়ন্ত্রণ গ্রুপের বেঁচে থাকার হার ছিল 95 ± 7%। পরীক্ষিত 34টি ইন্ডোলের মধ্যে, 1 mM ঘনত্বে 5-আয়োডোইন্ডোল এবং 4-ফ্লুরোইন্ডোল 100% মৃত্যুহার ঘটিয়েছে, যেখানে 5,6-ডাইফ্লুরোইন্ডিগো, মিথাইলইন্ডোল-7-কার্বোক্সিলেট এবং 7-আয়োডোইন্ডোল প্রায় 50% মৃত্যুহার ঘটিয়েছে (সারণি 1)।
পাইন কাঠ নেমাটোডের ভ্যাকুওল গঠন এবং বিপাকের উপর ৫-আইওডোইনডোলের প্রভাব। (A) পূর্ণাঙ্গ পুরুষ নেমাটোড, (B) L1 পর্যায়ের নেমাটোডের ডিম এবং (C) B. xylophilus-এর বিপাকের উপর অ্যাভারমেকটিন এবং ৫-আইওডোইনডোলের প্রভাব, (i) ০ ঘণ্টায় কোনো ভ্যাকুওল দেখা যায়নি, প্রয়োগের ফলে (ii) ভ্যাকুওল, (iii) একাধিক ভ্যাকুওলের পুঞ্জীভবন, (iv) ভ্যাকুওলের স্ফীতি, (v) ভ্যাকুওলের সংযোজন এবং (vi) বৃহৎ ভ্যাকুওলের গঠন পরিলক্ষিত হয়। লাল তীরচিহ্নগুলো ভ্যাকুওলের স্ফীতি, নীল তীরচিহ্নগুলো ভ্যাকুওলের সংযোজন এবং কালো তীরচিহ্নগুলো বৃহৎ ভ্যাকুওল নির্দেশ করে। স্কেল বার = ৫০ μm।
এছাড়াও, এই গবেষণায় পাইন নেমাটোডে মিথেন-প্ররোচিত মৃত্যুর ক্রমিক প্রক্রিয়াও বর্ণনা করা হয়েছে (চিত্র 4C)। মিথেনোজেনিক মৃত্যু হলো এক প্রকার নন-অ্যাপোপটোটিক কোষ মৃত্যু যা সুস্পষ্ট সাইটোপ্লাজমিক ভ্যাকুওলের সঞ্চয়ের সাথে সম্পর্কিত। পাইন নেমাটোডে পরিলক্ষিত রূপগত ত্রুটিগুলো মিথেন-প্ররোচিত মৃত্যুর প্রক্রিয়ার সাথে ঘনিষ্ঠভাবে সম্পর্কিত বলে মনে হয়। বিভিন্ন সময়ে আণুবীক্ষণিক পরীক্ষায় দেখা গেছে যে 5-আয়োডোইনডোল (0.1 mM) এর সংস্পর্শে আসার 20 ঘন্টা পরে বিশাল ভ্যাকুওল তৈরি হয়েছিল। চিকিৎসার 8 ঘন্টা পরে আণুবীক্ষণিক ভ্যাকুওল দেখা গিয়েছিল এবং 12 ঘন্টা পরে তাদের সংখ্যা বৃদ্ধি পেয়েছিল। 14 ঘন্টা পরে বেশ কয়েকটি বড় ভ্যাকুওল দেখা গিয়েছিল। চিকিৎসার 12-16 ঘন্টা পরে বেশ কয়েকটি সংযুক্ত ভ্যাকুওল স্পষ্টভাবে দৃশ্যমান ছিল, যা ইঙ্গিত করে যে ভ্যাকুওল সংযুক্তি হলো মিথেনোজেনিক মৃত্যু প্রক্রিয়ার ভিত্তি। 20 ঘন্টা পরে, কৃমিটির সর্বত্র বেশ কয়েকটি বিশাল ভ্যাকুওল পাওয়া গিয়েছিল। এই পর্যবেক্ষণগুলো সি. এলিগ্যান্সে মেটিউওসিসের প্রথম প্রতিবেদন।
৫-আইওডোইনডোল দ্বারা চিকিৎসাকৃত কৃমিগুলিতে ভ্যাকুওলের একত্রীকরণ এবং ফেটে যাওয়াও পরিলক্ষিত হয়েছিল (চিত্র ৫), যার প্রমাণ হলো কৃমির বেঁকে যাওয়া এবং পরিবেশে ভ্যাকুওলের নির্গমন। ডিমের খোসার ঝিল্লিতেও ভ্যাকুওলের ভাঙন দেখা গিয়েছিল, যা সাধারণত ডিম ফোটার সময় L2 দ্বারা অক্ষত রাখা হয় (পরিপূরক চিত্র S2)। এই পর্যবেক্ষণগুলি ভ্যাকুওল গঠন এবং পুঁজ নিঃসরণের প্রক্রিয়ায় তরল জমা হওয়া এবং অসমোরেগুলেটরি ব্যর্থতার পাশাপাশি প্রতিবর্তনযোগ্য কোষীয় আঘাতের (RCI) জড়িত থাকার বিষয়টিকে সমর্থন করে (চিত্র ৫)।
পর্যবেক্ষিত ভ্যাকুওল গঠনে আয়োডিনের ভূমিকা অনুমান করে, আমরা সোডিয়াম আয়োডাইড (NaI) এবং পটাশিয়াম আয়োডাইডের (KI) নেমাটোড-নাশক ক্রিয়াকলাপ পরীক্ষা করে দেখেছি। তবে, ০.১, ০.৫ বা ১ mM ঘনত্বে, এগুলো নেমাটোডের বেঁচে থাকা বা ভ্যাকুওল গঠন কোনোটিকেই প্রভাবিত করেনি (পরিপূরক চিত্র S5), যদিও ১ mM KI-এর সামান্য নেমাটোড-নাশক প্রভাব ছিল। অন্যদিকে, ৫-আয়োডোইনডোলের মতো ৭-আয়োডোইনডোল (১ বা ২ mM) একাধিক ভ্যাকুওল এবং গাঠনিক বিকৃতি সৃষ্টি করেছিল (পরিপূরক চিত্র S6)। পাইন নেমাটোডের ক্ষেত্রে এই দুটি আয়োডোইনডোল একই রকম ফিনোটাইপিক বৈশিষ্ট্য দেখিয়েছে, যেখানে NaI এবং KI তা দেখায়নি। মজার বিষয় হলো, পরীক্ষিত ঘনত্বে ইনডোল B. xylophilus-এর মধ্যে ভ্যাকুওল গঠন করতে পারেনি (তথ্য দেখানো হয়নি)। সুতরাং, ফলাফল থেকে নিশ্চিত হওয়া যায় যে, ইন্ডোল-আয়োডিন জটিল যৌগটি B. xylophilus-এর ভ্যাকুওলাইজেশন এবং বিপাকের জন্য দায়ী।
নেমাটিসাইডাল কার্যকলাপের জন্য পরীক্ষিত ইন্ডোলগুলির মধ্যে, 5-আয়োডোইন্ডোলের স্লিপ ইনডেক্স ছিল সর্বোচ্চ (-5.89 kcal/mol), এরপরে ছিল 7-আয়োডোইন্ডোল (-4.48 kcal/mol), 4-ফ্লুরোইন্ডোল (-4.33), এবং ইন্ডোল (-4.03) (চিত্র 6)। লিউসিন 218-এর সাথে 5-আয়োডোইন্ডোলের শক্তিশালী ব্যাকবোন হাইড্রোজেন বন্ধন এর বন্ধনকে স্থিতিশীল করে, যেখানে অন্য সমস্ত ইন্ডোল ডেরিভেটিভ সাইড চেইন হাইড্রোজেন বন্ধনের মাধ্যমে সেরিন 260-এর সাথে আবদ্ধ হয়। অন্যান্য মডেলকৃত আয়োডোইনডোলগুলোর মধ্যে, ২-আয়োডোইনডোলের বন্ধন মান হলো -৫.২৪৮ কিলোক্যালরি/মোল, যা লিউসিন ২১৮-এর সাথে এর প্রধান হাইড্রোজেন বন্ধনের কারণে হয়ে থাকে। অন্যান্য জ্ঞাত বন্ধনগুলোর মধ্যে রয়েছে ৩-আয়োডোইনডোল (-৪.৩ কিলোক্যালরি/মোল), ৪-আয়োডোইনডোল (-৪.০ কিলোক্যালরি/মোল), এবং ৬-ফ্লুরোইনডোল (-২.৬ কিলোক্যালরি/মোল) (পরিশিষ্ট চিত্র S8)। ৫-আইওডোইনডোল এবং ২-আইওডোইনডোল ব্যতীত, বেশিরভাগ হ্যালোজিনেটেড ইনডোল এবং স্বয়ং ইনডোল সেরিন ২৬০-এর সাথে একটি বন্ধন তৈরি করে। লিউসিন ২১৮-এর সাথে হাইড্রোজেন বন্ধন যে কার্যকর রিসেপ্টর-লিগ্যান্ড বন্ধনের নির্দেশক, যেমনটি আইভারমেকটিনের ক্ষেত্রে দেখা গেছে (পরিপূরক চিত্র S7), তা নিশ্চিত করে যে ৫-আইওডোইনডোল এবং ২-আইওডোইনডোল, আইভারমেকটিনের মতোই, লিউসিন ২১৮-এর মাধ্যমে GluCL রিসেপ্টরের সক্রিয় স্থানে দৃঢ়ভাবে আবদ্ধ হয় (চিত্র ৬ এবং পরিপূরক চিত্র S8)। আমরা প্রস্তাব করছি যে এই বন্ধনটি GluCL কমপ্লেক্সের উন্মুক্ত ছিদ্র কাঠামো বজায় রাখার জন্য প্রয়োজনীয় এবং GluCL রিসেপ্টরের সক্রিয় স্থানে দৃঢ়ভাবে আবদ্ধ হওয়ার মাধ্যমে, ৫-আইওডোইনডোল, ২-আইওডোইনডোল, অ্যাভারমেকটিন এবং আইভারমেকটিন আয়ন চ্যানেলটিকে উন্মুক্ত রাখে এবং তরল শোষণে সহায়তা করে।
GluCL-এর সাথে ইন্ডোল এবং হ্যালোজেনেটেড ইন্ডোলের আণবিক ডকিং। GluCL-এর সক্রিয় স্থানে (A) ইন্ডোল, (B) ৪-ফ্লুরোইন্ডোল, (C) ৭-আয়োডোইন্ডোল, এবং (D) ৫-আয়োডোইন্ডোল লিগ্যান্ডগুলির বন্ধন অভিমুখ। প্রোটিনটিকে একটি ফিতা দ্বারা উপস্থাপন করা হয়েছে, এবং ব্যাকবোন হাইড্রোজেন বন্ধনগুলিকে হলুদ ডটেড লাইন হিসাবে দেখানো হয়েছে। (A′), (B′), (C′), এবং (D′) সংশ্লিষ্ট লিগ্যান্ডগুলির পার্শ্ববর্তী অ্যামিনো অ্যাসিড রেসিডিউগুলির সাথে মিথস্ক্রিয়া দেখায়, এবং সাইড-চেইন হাইড্রোজেন বন্ধনগুলিকে গোলাপী ডটেড তীরচিহ্ন দ্বারা নির্দেশ করা হয়েছে।
বাঁধাকপি এবং মুলা বীজের অঙ্কুরোদগমের উপর ৫-আইওডোইনডোলের বিষাক্ত প্রভাব মূল্যায়নের জন্য পরীক্ষা চালানো হয়েছিল। ৫-আইওডোইনডোল (০.০৫ বা ০.১ mM) অথবা অ্যাভারমেকটিন (১০ μg/mL) প্রাথমিক অঙ্কুরোদগম এবং চারাগাছের উদ্ভবের উপর সামান্য বা কোনো প্রভাব ফেলেনি (চিত্র ৭)। এছাড়াও, অপরিশোধিত নিয়ন্ত্রিত বীজ এবং ৫-আইওডোইনডোল বা অ্যাভারমেকটিন দ্বারা শোধিত বীজের অঙ্কুরোদগম হারের মধ্যে কোনো উল্লেখযোগ্য পার্থক্য পাওয়া যায়নি। প্রধান মূলের প্রসারণ এবং গঠিত পার্শ্বমূলের সংখ্যার উপর এর প্রভাব ছিল নগণ্য, যদিও ১ mM (এর সক্রিয় ঘনত্বের ১০ গুণ) ৫-আইওডোইনডোল পার্শ্বমূলের বিকাশকে সামান্য বিলম্বিত করেছিল। এই ফলাফলগুলি নির্দেশ করে যে ৫-আইওডোইনডোল উদ্ভিদ কোষের জন্য অবিষাক্ত এবং পরীক্ষিত ঘনত্বে এটি উদ্ভিদের বিকাশ প্রক্রিয়ায় হস্তক্ষেপ করে না।
বীজের অঙ্কুরোদগমের উপর ৫-আইওডোইনডোলের প্রভাব। অ্যাভারমেকটিন বা ৫-আইওডোইনডোল সহ বা ছাড়া মুরাশিগে ও স্কুগ অ্যাগার মাধ্যমে B. oleracea এবং R. raphanistrum বীজের অঙ্কুরোদগম, চারা গজানো এবং পার্শ্বমূল তৈরি। ২২°C তাপমাত্রায় ৩ দিন ইনকিউবেশনের পর অঙ্কুরোদগম রেকর্ড করা হয়েছিল।
এই গবেষণায় ইন্ডোল দ্বারা নেমাটোড হত্যার বেশ কয়েকটি ঘটনা তুলে ধরা হয়েছে। গুরুত্বপূর্ণভাবে, এটিই প্রথম প্রতিবেদন যেখানে আয়োডোইন্ডোল পাইন পাতায় মিথাইলেশন (এমন একটি প্রক্রিয়া যা ছোট ছোট ভ্যাকুওলের জমা হওয়ার ফলে ঘটে, যা ধীরে ধীরে একত্রিত হয়ে বিশাল ভ্যাকুওলে পরিণত হয় এবং অবশেষে ঝিল্লি ফেটে গিয়ে মৃত্যু ঘটায়) প্ররোচিত করে, এবং এতে আয়োডোইন্ডোল বাণিজ্যিক নেমাটিসাইড অ্যাভারমেকটিনের অনুরূপ উল্লেখযোগ্য নেমাটিসাইডাল বৈশিষ্ট্য প্রদর্শন করে।
পূর্বে প্রোক্যারিওট এবং ইউক্যারিওট জীবে ইন্ডোলসমূহের একাধিক সংকেত প্রদানের কার্যকারিতা সম্পর্কে প্রতিবেদন করা হয়েছে, যার মধ্যে রয়েছে বায়োফিল্ম প্রতিরোধ/গঠন, ব্যাকটেরিয়ার টিকে থাকা এবং রোগ সৃষ্টিকারী ক্ষমতা¹⁹,³²,³³,³⁴। সম্প্রতি, হ্যালোজিনেটেড ইন্ডোল, ইন্ডোল অ্যালকালয়েড এবং আধা-সংশ্লেষিত ইন্ডোল ডেরিভেটিভের সম্ভাব্য চিকিৎসাগত প্রভাব ব্যাপক গবেষণার আগ্রহ আকর্ষণ করেছে³⁵,³⁶,³⁷। উদাহরণস্বরূপ, হ্যালোজিনেটেড ইন্ডোলসমূহকে দীর্ঘস্থায়ী এসচেরিকিয়া কোলাই এবং স্ট্যাফাইলোকক্কাস অরিয়াস কোষ ধ্বংস করতে দেখা গেছে³⁷। এছাড়াও, অন্যান্য প্রজাতি, গণ এবং রাজ্যের বিরুদ্ধে হ্যালোজিনেটেড ইন্ডোলের কার্যকারিতা নিয়ে গবেষণা করা বৈজ্ঞানিকভাবে আগ্রহের বিষয়, এবং এই গবেষণাটি সেই লক্ষ্য অর্জনের দিকে একটি পদক্ষেপ।
এখানে, আমরা রিভার্সিবল সেল ইনজুরি (RCI) এবং মিথাইলেশনের উপর ভিত্তি করে সি. এলিগ্যান্সে 5-আইওডোইনডোল-প্ররোচিত প্রাণঘাতীতার একটি প্রক্রিয়া প্রস্তাব করছি (চিত্র 4C এবং 5)। ফোলাভাব এবং ভ্যাকুওলার অবক্ষয়ের মতো শোথজনিত পরিবর্তনগুলি RCI এবং মিথাইলেশনের সূচক, যা সাইটোপ্লাজমে বিশাল ভ্যাকুওল হিসাবে প্রকাশিত হয়48,49। RCI ATP উৎপাদন হ্রাস করে, ATPase পাম্পের ব্যর্থতা ঘটিয়ে, অথবা কোষ ঝিল্লি ভেঙে দিয়ে এবং Na+, Ca2+, এবং জলের দ্রুত অন্তঃপ্রবাহ ঘটিয়ে শক্তি উৎপাদনে বাধা দেয়50,51,52। Ca2+ এবং জলের অন্তঃপ্রবাহের কারণে সাইটোপ্লাজমে তরল জমার ফলে প্রাণী কোষে অন্তঃসাইটোপ্লাজমিক ভ্যাকুওল তৈরি হয়53। মজার ব্যাপার হলো, কোষের ক্ষতির এই প্রক্রিয়াটি পুনরুদ্ধারযোগ্য যদি ক্ষতিটি অস্থায়ী হয় এবং কোষগুলো একটি নির্দিষ্ট সময়ের জন্য ATP উৎপাদন শুরু করে, কিন্তু যদি ক্ষতিটি স্থায়ী হয় বা আরও খারাপ হয়, তাহলে কোষগুলো মারা যায়।৫৪ আমাদের পর্যবেক্ষণ দেখায় যে ৫-আইওডোইনডোল দিয়ে চিকিৎসা করা নেমাটোডগুলো প্রতিকূল পরিস্থিতির সংস্পর্শে আসার পর স্বাভাবিক জৈব সংশ্লেষণ পুনরুদ্ধার করতে অক্ষম।
B. xylophilus-এ 5-আয়োডোইনডোল দ্বারা প্ররোচিত মিথাইলেশন ফেনোটাইপটি আয়োডিনের উপস্থিতি এবং এর আণবিক বিন্যাসের কারণে হতে পারে, যেহেতু 7-আয়োডোইনডোলের তুলনায় 5-আয়োডোইনডোলের B. xylophilus-এর উপর কম প্রতিরোধমূলক প্রভাব ছিল (সারণী 1 এবং পরিপূরক চিত্র S6)। এই ফলাফলগুলি মাল্টিজ এট আল. (2014)-এর গবেষণার সাথে আংশিকভাবে সামঞ্জস্যপূর্ণ, যারা রিপোর্ট করেছিলেন যে ইনডোলের পাইরিডাইল নাইট্রোজেন অংশটির প্যারা-অবস্থান থেকে মেটা-অবস্থানে স্থানান্তর U251 কোষে ভ্যাকুওলাইজেশন, বৃদ্ধি বাধা এবং সাইটোটক্সিসিটি দূর করে, যা ইঙ্গিত দেয় যে প্রোটিনের একটি নির্দিষ্ট সক্রিয় স্থানের সাথে অণুর মিথস্ক্রিয়া অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ27,44,45। এই গবেষণায় ইনডোল বা হ্যালোজেনেটেড ইনডোল এবং GluCL রিসেপ্টরগুলির মধ্যে পর্যবেক্ষণ করা মিথস্ক্রিয়াগুলিও এই ধারণাটিকে সমর্থন করে, কারণ 5- এবং 2-আয়োডোইনডোল পরীক্ষিত অন্যান্য ইনডোলগুলির তুলনায় GluCL রিসেপ্টরগুলির সাথে আরও দৃঢ়ভাবে আবদ্ধ হতে দেখা গেছে (চিত্র 6 এবং পরিপূরক চিত্র S8)। দেখা গেছে যে, ইন্ডোলের দ্বিতীয় বা পঞ্চম অবস্থানে থাকা আয়োডিন, গ্লুসিএল (GluCL) রিসেপ্টরের লিউসিন ২১৮-এর সাথে ব্যাকবোন হাইড্রোজেন বন্ধনের মাধ্যমে যুক্ত হয়, যেখানে অন্যান্য হ্যালোজেনেটেড ইন্ডোল এবং স্বয়ং ইন্ডোল সেরিন ২৬০-এর সাথে দুর্বল সাইড-চেইন হাইড্রোজেন বন্ধন তৈরি করে (চিত্র ৬)। তাই আমরা অনুমান করি যে, ভ্যাকুওলার অবক্ষয় ঘটাতে হ্যালোজেনের অবস্থান একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে, অপরদিকে ৫-আয়োডোইন্ডোলের দৃঢ় বন্ধন আয়ন চ্যানেলকে খোলা রাখে, যার ফলে দ্রুত তরল প্রবেশ এবং ভ্যাকুওলের ফেটে যাওয়া সম্ভব হয়। তবে, ৫-আয়োডোইন্ডোলের কার্যপ্রণালীর বিস্তারিত প্রক্রিয়া এখনও নির্ধারণ করা বাকি আছে।
৫-আইওডোইনডোলের ব্যবহারিক প্রয়োগের পূর্বে উদ্ভিদের উপর এর বিষাক্ত প্রভাব বিশ্লেষণ করা উচিত। আমাদের বীজ অঙ্কুরোদগম পরীক্ষা থেকে দেখা গেছে যে, পরীক্ষিত ঘনত্বে ৫-আইওডোইনডোলের বীজ অঙ্কুরোদগম বা পরবর্তী বিকাশ প্রক্রিয়ার উপর কোনো নেতিবাচক প্রভাব ছিল না (চিত্র ৭)। সুতরাং, এই গবেষণাটি পাইন গাছের প্রতি পাইন নেমাটোডের ক্ষতিকর প্রভাব নিয়ন্ত্রণের জন্য বাস্তুতান্ত্রিক পরিবেশে ৫-আইওডোইনডোল ব্যবহারের একটি ভিত্তি প্রদান করে।
পূর্ববর্তী প্রতিবেদনগুলিতে দেখানো হয়েছে যে ইন্ডোল-ভিত্তিক থেরাপি অ্যান্টিবায়োটিক প্রতিরোধ এবং ক্যান্সারের অগ্রগতির সমস্যা মোকাবেলার জন্য একটি সম্ভাব্য পন্থা। এছাড়াও, ইন্ডোলের মধ্যে অ্যান্টিব্যাকটেরিয়াল, অ্যান্টিক্যান্সার, অ্যান্টিঅক্সিডেন্ট, অ্যান্টি-ইনফ্ল্যামেটরি, অ্যান্টিডায়াবেটিক, অ্যান্টিভাইরাল, অ্যান্টিপ্রোলিফেরেটিভ এবং অ্যান্টিটিউবারকুলোসিস কার্যকলাপ রয়েছে এবং এটি ওষুধ তৈরির জন্য একটি প্রতিশ্রুতিশীল ভিত্তি হিসাবে কাজ করতে পারে। এই গবেষণাটি প্রথমবারের মতো অ্যান্টিপ্যারাসাইটিক এবং অ্যান্টিহেলমিন্টিক এজেন্ট হিসাবে আয়োডিনের সম্ভাব্য ব্যবহারের পরামর্শ দেয়।
অ্যাভারমেকটিন তিন দশক আগে আবিষ্কৃত হয়েছিল এবং ২০১৫ সালে নোবেল পুরস্কার লাভ করে, এবং কৃমিনাশক হিসেবে এর ব্যবহার এখনও সক্রিয়ভাবে চলছে। তবে, নেমাটোড এবং অন্যান্য কীটপতঙ্গের মধ্যে অ্যাভারমেকটিনের বিরুদ্ধে দ্রুত প্রতিরোধ ক্ষমতা গড়ে ওঠার কারণে, পাইন গাছে পাইন নেমাটোডের সংক্রমণ নিয়ন্ত্রণের জন্য একটি বিকল্প, স্বল্প-ব্যয়ী এবং পরিবেশ-বান্ধব কৌশলের প্রয়োজন। এই গবেষণায় আরও জানানো হয়েছে যে, ৫-আইওডোইনডোল কীভাবে পাইন নেমাটোডকে ধ্বংস করে এবং উদ্ভিদ কোষের জন্য এর বিষক্রিয়া কম, যা এর ভবিষ্যৎ বাণিজ্যিক প্রয়োগের জন্য উজ্জ্বল সম্ভাবনা তৈরি করে।
সমস্ত পরীক্ষা-নিরীক্ষা কোরিয়ার গিয়ংসানে অবস্থিত ইয়ংনাম বিশ্ববিদ্যালয়ের নীতিশাস্ত্র কমিটি কর্তৃক অনুমোদিত হয়েছিল এবং পদ্ধতিগুলো ইয়ংনাম বিশ্ববিদ্যালয়ের নীতিশাস্ত্র কমিটির নির্দেশিকা অনুসারে সম্পাদিত হয়েছিল।
প্রতিষ্ঠিত পদ্ধতি⁴³ ব্যবহার করে ডিম ফোটানোর পরীক্ষা করা হয়েছিল। ডিম ফোটার হার (HR) নির্ণয় করার জন্য, ১-দিন বয়সী পূর্ণাঙ্গ নেমাটোড (প্রায় ১০০টি স্ত্রী এবং ১০০টি পুরুষ) ছত্রাকযুক্ত পেট্রি ডিশে স্থানান্তর করা হয়েছিল এবং ২৪ ঘণ্টা ধরে বাড়তে দেওয়া হয়েছিল। এরপর ডিমগুলো আলাদা করে জীবাণুমুক্ত পাতিত জলে সাসপেনশন হিসেবে ৫-আইওডোইনডোল (০.০৫ mM এবং ০.১ mM) বা অ্যাভারমেকটিন (১০ μg/ml) দিয়ে শোধন করা হয়েছিল। এই সাসপেনশনগুলো (৫০০ μl; প্রায় ১০০টি ডিম) একটি ২৪-ওয়েল টিস্যু কালচার প্লেটের ওয়েলগুলিতে স্থানান্তর করা হয়েছিল এবং ২২ °C তাপমাত্রায় ইনকিউবেট করা হয়েছিল। ২৪ ঘণ্টা ইনকিউবেশনের পর L2 গণনা করা হয়েছিল, কিন্তু একটি সূক্ষ্ম প্ল্যাটিনাম তার দিয়ে উদ্দীপিত করার পরেও কোষগুলো নড়াচড়া না করলে সেগুলোকে মৃত বলে গণ্য করা হয়েছিল। এই পরীক্ষাটি দুটি পর্যায়ে পরিচালিত হয়েছিল, প্রতিটি পর্যায়ে ছয়টি পুনরাবৃত্তি ছিল। উভয় পরীক্ষার তথ্য একত্রিত করে উপস্থাপন করা হয়েছে। HR-এর শতাংশ নিম্নলিখিতভাবে গণনা করা হয়:
পূর্বে বিকশিত পদ্ধতি ব্যবহার করে লার্ভার মৃত্যুহার নির্ণয় করা হয়েছিল। নেমাটোডের ডিম সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং L2 পর্যায়ের লার্ভা তৈরির জন্য জীবাণুমুক্ত পাতিত জলে ভ্রূণ ফুটিয়ে তাদের সিনক্রোনাইজ করা হয়েছিল। সিনক্রোনাইজড লার্ভাগুলোকে (প্রায় ৫০০টি নেমাটোড) ৫-আইওডোইনডোল (০.০৫ mM এবং ০.১ mM) অথবা অ্যাভারমেকটিন (১০ μg/ml) দিয়ে ট্রিটমেন্ট করা হয়েছিল এবং B. cinerea পেট্রি প্লেটে প্রতিপালন করা হয়েছিল। ২২ °C তাপমাত্রায় ৪৮ ঘণ্টা ইনকিউবেশনের পর, নেমাটোডগুলোকে জীবাণুমুক্ত পাতিত জলে সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং L2, L3, ও L4 পর্যায়ের উপস্থিতি পরীক্ষা করা হয়েছিল। L3 এবং L4 পর্যায়ের উপস্থিতি লার্ভার রূপান্তর নির্দেশ করে, যেখানে L2 পর্যায়ের উপস্থিতি কোনো রূপান্তর না হওয়া নির্দেশ করে। iRiS™ ডিজিটাল সেল ইমেজিং সিস্টেম ব্যবহার করে ছবিগুলো সংগ্রহ করা হয়েছিল। এই পরীক্ষাটি দুটি পর্যায়ে পরিচালিত হয়েছিল, প্রতিটি পর্যায়ে ছয়টি পুনরাবৃত্তি ছিল। উভয় পরীক্ষার ডেটা একত্রিত করে উপস্থাপন করা হয়েছে।
মুরাশিগে ও স্কুগ অ্যাগার প্লেটে অঙ্কুরোদগম পরীক্ষার মাধ্যমে বীজের উপর ৫-আইওডোইনডোল এবং অ্যাভারমেকটিনের বিষাক্ততা মূল্যায়ন করা হয়েছিল।৬২ B. oleracea এবং R. raphanistrum-এর বীজ প্রথমে একদিনের জন্য জীবাণুমুক্ত পাতিত জলে ভিজিয়ে রাখা হয়েছিল, ১ মিলি ১০০% ইথানল দিয়ে ধোয়া হয়েছিল, ১ মিলি ৫০% বাণিজ্যিক ব্লিচ (৩% সোডিয়াম হাইপোক্লোরাইট) দিয়ে ১৫ মিনিটের জন্য জীবাণুমুক্ত করা হয়েছিল এবং ১ মিলি জীবাণুমুক্ত জল দিয়ে পাঁচবার ধোয়া হয়েছিল। এরপর জীবাণুমুক্ত বীজগুলোকে ০.৮৬ গ্রাম/লিটার (০.২X) মুরাশিগে ও স্কুগ মিডিয়াম এবং ০.৭% ব্যাকটেরিওলজিক্যাল অ্যাগারযুক্ত অঙ্কুরোদগম অ্যাগার প্লেটে চাপ দিয়ে বসানো হয়েছিল, যেখানে ৫-আইওডোইনডোল বা অ্যাভারমেকটিন ছিল বা ছিল না। এরপর প্লেটগুলোকে ২২ °C তাপমাত্রায় ইনকিউবেট করা হয়েছিল এবং ৩ দিন ইনকিউবেশনের পর ছবি তোলা হয়েছিল। এই পরীক্ষাটি দুটি পর্যায়ে পরিচালিত হয়েছিল, যার প্রতিটিতে ছয়টি পুনরাবৃত্তি ছিল।