ছোট জলজ ব্যাঙাচির উপর বাণিজ্যিক সাইপারমেথ্রিন প্রস্তুতির মৃত্যুহার এবং বিষাক্ততা

এই গবেষণায় বাণিজ্যিক পণ্যের প্রাণঘাতীতা, আংশিক প্রাণঘাতীতা এবং বিষাক্ততা মূল্যায়ন করা হয়েছে।সাইপারমেথ্রিনঅ্যানুরান ব্যাঙাচির উপর সাইপারমেথ্রিন ফর্মুলেশনের প্রয়োগ। তীব্র পরীক্ষায়, ১০০–৮০০ μg/L ঘনত্ব ৯৬ ঘণ্টা ধরে পরীক্ষা করা হয়েছিল। দীর্ঘস্থায়ী পরীক্ষায়, প্রাকৃতিকভাবে প্রাপ্ত সাইপারমেথ্রিনের ঘনত্ব (১, ৩, ৬, এবং ২০ μg/L) মৃত্যুহারের জন্য পরীক্ষা করা হয়েছিল, এবং এর পরে ৭ দিন ধরে মাইক্রোনিউক্লিয়াস পরীক্ষা ও লোহিত রক্তকণিকার নিউক্লিয়াসের অস্বাভাবিকতা পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল। ব্যাঙাচির জন্য বাণিজ্যিক সাইপারমেথ্রিন ফর্মুলেশনের LC50 ছিল ২৭৩.৪১ μg L−1। দীর্ঘস্থায়ী পরীক্ষায়, সর্বোচ্চ ঘনত্ব (২০ μg L−1) ৫০%-এর বেশি মৃত্যুহারের কারণ হয়েছিল, কারণ এটি পরীক্ষিত ব্যাঙাচিগুলোর অর্ধেককে মেরে ফেলেছিল। মাইক্রোনিউক্লিয়াস পরীক্ষায় ৬ এবং ২০ μg L−1 ঘনত্বে উল্লেখযোগ্য ফলাফল দেখা গেছে এবং বেশ কিছু নিউক্লিয়াসের অস্বাভাবিকতা শনাক্ত করা হয়েছে, যা ইঙ্গিত করে যে বাণিজ্যিক সাইপারমেথ্রিন ফর্মুলেশনটির P. gracilis-এর বিরুদ্ধে জিনোটক্সিক ক্ষমতা রয়েছে। এই প্রজাতির জন্য সাইপারমেথ্রিন একটি উচ্চ ঝুঁকি, যা নির্দেশ করে যে এটি স্বল্প ও দীর্ঘমেয়াদে একাধিক সমস্যা সৃষ্টি করতে পারে এবং এই বাস্তুতন্ত্রের গতিপ্রকৃতিকে প্রভাবিত করতে পারে। অতএব, এই সিদ্ধান্তে আসা যায় যে বাণিজ্যিক সাইপারমেথ্রিন ফর্মুলেশনগুলো পি. গ্র্যাসিলিস-এর উপর বিষাক্ত প্রভাব ফেলে।
কৃষি কার্যক্রমের ক্রমাগত সম্প্রসারণ এবং নিবিড় প্রয়োগের কারণেকীটপতঙ্গ নিয়ন্ত্রণবিভিন্ন পদক্ষেপের ফলে, জলজ প্রাণীরা প্রায়শই কীটনাশকের সংস্পর্শে আসে¹,²। কৃষি ক্ষেত্রের নিকটবর্তী জল সম্পদের দূষণ উভচর প্রাণীর মতো অ-লক্ষ্য জীবের বিকাশ এবং বেঁচে থাকাকে প্রভাবিত করতে পারে।
পরিবেশগত ম্যাট্রিক্সের মূল্যায়নে উভচর প্রাণীরা ক্রমশ গুরুত্বপূর্ণ হয়ে উঠছে। অ্যানুরানদের (Anurans) পরিবেশগত দূষণকারী পদার্থের ভালো জৈব-সূচক হিসেবে বিবেচনা করা হয়, কারণ তাদের কিছু অনন্য বৈশিষ্ট্য রয়েছে, যেমন—জটিল জীবনচক্র, দ্রুত লার্ভা বৃদ্ধির হার, ট্রফিক অবস্থা, ভেদ্য ত্বক¹⁰,¹¹, প্রজননের জন্য জলের উপর নির্ভরতা¹² এবং অরক্ষিত ডিম¹¹,¹³,¹⁴। ছোট জল ব্যাঙ (Physalaemus gracilis), যা সাধারণত ক্রন্দনরত ব্যাঙ (weeping frog) নামে পরিচিত, কীটনাশক দূষণের একটি জৈব-সূচক প্রজাতি হিসেবে প্রমাণিত হয়েছে⁴,⁵,⁶,⁷,¹⁵। এই প্রজাতিটি আর্জেন্টিনা, উরুগুয়ে, প্যারাগুয়ে এবং ব্রাজিলের স্থির জল, সংরক্ষিত এলাকা বা পরিবর্তনশীল আবাসস্থলে পাওয়া যায়¹⁶¹⁷ এবং এর ব্যাপক বিস্তৃতি ও বিভিন্ন আবাসস্থলের প্রতি সহনশীলতার কারণে IUCN শ্রেণিবিন্যাস অনুসারে এটিকে স্থিতিশীল বলে মনে করা হয়¹⁸।
সাইপারমেথ্রিনের সংস্পর্শে আসার পর উভচর প্রাণীদের মধ্যে প্রাণঘাতী নয় এমন প্রভাবের খবর পাওয়া গেছে, যার মধ্যে রয়েছে ব্যাঙাচির আচরণগত, অঙ্গসংস্থানিক এবং জৈব-রাসায়নিক পরিবর্তন²³,²⁴,²⁵, মৃত্যুহার এবং রূপান্তরের সময়ের পরিবর্তন, এনজাইমের পরিবর্তন, ডিম ফোটার সাফল্যের হার হ্রাস²⁴,²⁵, অতিসক্রিয়তা²⁶, কোলিনএস্টারেজ কার্যকলাপের বাধা²⁷ এবং সাঁতারের দক্ষতার পরিবর্তন⁷,²⁸। তবে, উভচর প্রাণীদের উপর সাইপারমেথ্রিনের জিনগত বিষাক্ত প্রভাব নিয়ে গবেষণা সীমিত। তাই, অ্যানুরান প্রজাতির সাইপারমেথ্রিনের প্রতি সংবেদনশীলতা মূল্যায়ন করা গুরুত্বপূর্ণ।
পরিবেশ দূষণ উভচর প্রাণীদের স্বাভাবিক বৃদ্ধি ও বিকাশকে প্রভাবিত করে, কিন্তু সবচেয়ে গুরুতর প্রতিকূল প্রভাব হল কীটনাশকের সংস্পর্শে আসার কারণে ডিএনএ-এর জিনগত ক্ষতি। রক্ত ​​কোষের আকারবিদ্যা বিশ্লেষণ দূষণ এবং বন্য প্রজাতির জন্য কোনও পদার্থের সম্ভাব্য বিষাক্ততার একটি গুরুত্বপূর্ণ জৈব নির্দেশক। মাইক্রোনিউক্লিয়াস পরীক্ষা পরিবেশে রাসায়নিক পদার্থের জিনগত বিষাক্ততা নির্ধারণের জন্য সবচেয়ে সাধারণভাবে ব্যবহৃত পদ্ধতিগুলির মধ্যে একটি। এটি একটি দ্রুত, কার্যকর এবং সস্তা পদ্ধতি যা উভচর প্রাণীর মতো জীবের রাসায়নিক দূষণের একটি ভাল নির্দেশক এবং জিনগত বিষাক্ত দূষকের সংস্পর্শ সম্পর্কে তথ্য সরবরাহ করতে পারে।
এই গবেষণার উদ্দেশ্য ছিল মাইক্রোনিউক্লিয়াস পরীক্ষা এবং পরিবেশগত ঝুঁকি মূল্যায়নের মাধ্যমে ছোট জলজ ব্যাঙাচির উপর বাণিজ্যিক সাইপারমেথ্রিন ফর্মুলেশনের বিষাক্ততার সম্ভাবনা মূল্যায়ন করা।
পরীক্ষার তীব্র পর্যায়ে বাণিজ্যিক সাইপারমেথ্রিনের বিভিন্ন ঘনত্বের সংস্পর্শে আসা পি. গ্র্যাসিলিস ব্যাঙাচির ক্রমবর্ধমান মৃত্যুহার (%)।
একটি দীর্ঘস্থায়ী পরীক্ষা চলাকালীন বাণিজ্যিক সাইপারমেথ্রিনের বিভিন্ন ঘনত্বের সংস্পর্শে আসা পি. গ্র্যাসিলিস ব্যাঙাচির ক্রমবর্ধমান মৃত্যুহার (%)।
সাইপারমেথ্রিনের বিভিন্ন ঘনত্বের (৬ এবং ২০ μg/L) সংস্পর্শে আসা উভচর প্রাণীদের মধ্যে জিনোটক্সিক প্রভাবের ফলে উচ্চ মৃত্যুহার পরিলক্ষিত হয়েছে, যার প্রমাণ হলো লোহিত রক্তকণিকায় মাইক্রোনিউক্লিয়াস (MN) এবং নিউক্লিয়াসের অস্বাভাবিকতার উপস্থিতি। MN গঠন মাইটোসিসে ত্রুটি নির্দেশ করে এবং এটি মাইক্রোটিউবিউলের সাথে ক্রোমোজোমের দুর্বল বন্ধন, ক্রোমোজোম গ্রহণ ও পরিবহনের জন্য দায়ী প্রোটিন কমপ্লেক্সের ত্রুটি, ক্রোমোজোম বিভাজনে ত্রুটি এবং ডিএনএ ক্ষতি মেরামতে ত্রুটির সাথে সম্পর্কিত³⁸,³⁹ এবং কীটনাশক-প্ররোচিত জারণ চাপের সাথেও সম্পর্কিত হতে পারে⁴⁰,⁴¹। পরীক্ষিত সকল ঘনত্বেই অন্যান্য অস্বাভাবিকতা পরিলক্ষিত হয়েছে। সাইপারমেথ্রিনের ঘনত্ব বৃদ্ধির ফলে লোহিত রক্তকণিকায় নিউক্লিয়াসের অস্বাভাবিকতা সর্বনিম্ন (১ μg/L) এবং সর্বোচ্চ (২০ μg/L) মাত্রায় যথাক্রমে ৫% এবং ২০% বৃদ্ধি পেয়েছে। উদাহরণস্বরূপ, একটি প্রজাতির ডিএনএ-তে পরিবর্তন স্বল্প ও দীর্ঘমেয়াদী উভয় ক্ষেত্রেই টিকে থাকার জন্য গুরুতর পরিণতি ডেকে আনতে পারে, যার ফলে জনসংখ্যা হ্রাস, প্রজনন ক্ষমতার পরিবর্তন, অন্তঃপ্রজনন, জিনগত বৈচিত্র্যের ক্ষতি এবং পরিযানের হারের পরিবর্তন হতে পারে। এই সমস্ত কারণ প্রজাতির টিকে থাকা এবং রক্ষণাবেক্ষণের উপর প্রভাব ফেলতে পারে৪২,৪৩। লোহিত রক্তকণিকার অস্বাভাবিকতা সাইটোকাইনেসিসে বাধার ইঙ্গিত দিতে পারে, যার ফলে অস্বাভাবিক কোষ বিভাজন (দ্বি-নিউক্লিয়াসযুক্ত লোহিত রক্তকণিকা) ঘটে৪৪,৪৫; বহু-খণ্ডিত নিউক্লিয়াস হলো নিউক্লীয় পর্দার একাধিক খণ্ডযুক্ত স্ফীতি৪৬, যেখানে অন্যান্য লোহিত রক্তকণিকার অস্বাভাবিকতা ডিএনএ পরিবর্ধনের সাথে সম্পর্কিত হতে পারে, যেমন নিউক্লীয় কিডনি/ব্লেব৪৭। নিউক্লিয়াসবিহীন লোহিত রক্তকণিকার উপস্থিতি অক্সিজেন পরিবহনে প্রতিবন্ধকতার ইঙ্গিত দিতে পারে, বিশেষ করে দূষিত জলে৪৮,৪৯। অ্যাপোপটোসিস কোষের মৃত্যুকে নির্দেশ করে৫০।
অন্যান্য গবেষণাতেও সাইপারমেথ্রিনের জিনোটক্সিক প্রভাব দেখানো হয়েছে। কাবানা ও অন্যান্যরা⁵¹ ৯৬ ঘণ্টা ধরে উচ্চ ঘনত্বের সাইপারমেথ্রিনের (৫০০০ এবং ১০,০০০ μg L⁻¹) সংস্পর্শে আসার পর ওডন্টোফ্রাইনাস আমেরিকানাস কোষে মাইক্রোনিউক্লিয়াস এবং নিউক্লিয়াসের পরিবর্তন, যেমন দ্বিনিউক্লিয়াসযুক্ত কোষ এবং অ্যাপোপটোটিক কোষের উপস্থিতি প্রদর্শন করেছেন। সাইপারমেথ্রিন-প্ররোচিত অ্যাপোপটোসিস পি. বিলিগোনাইজেরাস⁵² এবং রাইনেলা এরিনারাম⁵³-এও শনাক্ত করা হয়েছিল। এই ফলাফলগুলি থেকে বোঝা যায় যে সাইপারমেথ্রিনের বিভিন্ন জলজ জীবের উপর জিনোটক্সিক প্রভাব রয়েছে এবং এমএন ও ইএনএ পরীক্ষা উভচর প্রাণীদের উপর সাবলেথাল প্রভাবের একটি সূচক হতে পারে এবং বিষাক্ত পদার্থের সংস্পর্শে আসা স্থানীয় প্রজাতি এবং বন্য জনগোষ্ঠীর ক্ষেত্রে প্রযোজ্য হতে পারে¹²।
সাইপারমেথ্রিনের বাণিজ্যিক ফর্মুলেশনগুলি একটি উচ্চ পরিবেশগত ঝুঁকি (তীব্র এবং দীর্ঘস্থায়ী উভয়ই) সৃষ্টি করে, যার HQs মার্কিন পরিবেশ সুরক্ষা সংস্থা (EPA) স্তর54 অতিক্রম করে, যা পরিবেশে উপস্থিত থাকলে প্রজাতিকে প্রতিকূলভাবে প্রভাবিত করতে পারে। দীর্ঘস্থায়ী ঝুঁকি মূল্যায়নে, মৃত্যুর জন্য NOEC ছিল 3 μg L−1, যা নিশ্চিত করে যে জলে প্রাপ্ত ঘনত্ব প্রজাতিটির জন্য ঝুঁকি সৃষ্টি করতে পারে55। এন্ডোসালফান এবং সাইপারমেথ্রিনের মিশ্রণের সংস্পর্শে আসা R. arenarum লার্ভার জন্য প্রাণঘাতী NOEC ছিল 168 ঘন্টা পরে 500 μg L−1; এই মান 336 ঘন্টা পরে 0.0005 μg L−1-এ নেমে আসে। লেখকরা দেখিয়েছেন যে সংস্পর্শের সময় যত দীর্ঘ হয়, প্রজাতিটির জন্য ক্ষতিকর ঘনত্ব তত কম হয়। এটিও উল্লেখ করা গুরুত্বপূর্ণ যে একই সংস্পর্শের সময়ে P. gracilis-এর তুলনায় NOEC মানগুলি বেশি ছিল, যা নির্দেশ করে যে সাইপারমেথ্রিনের প্রতি প্রজাতিটির প্রতিক্রিয়া প্রজাতি-নির্দিষ্ট। অধিকন্তু, মৃত্যুহারের পরিপ্রেক্ষিতে, সাইপারমেথ্রিনের সংস্পর্শে আসার পর পি. গ্র্যাসিলিস-এর CHQ মান ৬৪.৬৭-এ পৌঁছেছিল, যা মার্কিন পরিবেশ সুরক্ষা সংস্থা কর্তৃক নির্ধারিত রেফারেন্স মান৫৪-এর চেয়ে বেশি, এবং আর. এরিনারাম লার্ভার CHQ মানও এই মানের চেয়ে বেশি ছিল (৩৩৬ ঘণ্টা পর CHQ > ৩৮৮.০০), যা নির্দেশ করে যে পরীক্ষিত কীটনাশকগুলো বেশ কয়েকটি উভচর প্রজাতির জন্য উচ্চ ঝুঁকি সৃষ্টি করে। যেহেতু পি. গ্র্যাসিলিস-এর রূপান্তর সম্পূর্ণ করতে প্রায় ৩০ দিন সময় লাগে৫৬, তাই এই সিদ্ধান্তে আসা যায় যে সাইপারমেথ্রিনের পরীক্ষিত ঘনত্বগুলো আক্রান্ত প্রাণীদের অল্প বয়সে পূর্ণাঙ্গ বা প্রজনন পর্যায়ে প্রবেশে বাধা দিয়ে জনসংখ্যা হ্রাসে অবদান রাখতে পারে।
মাইক্রোনিউক্লিয়াই এবং অন্যান্য লোহিত রক্তকণিকার নিউক্লিয়াসের অস্বাভাবিকতার গণনাকৃত ঝুঁকি মূল্যায়নে, CHQ-এর মান ১৪.৯২ থেকে ৯৭.০০ পর্যন্ত ছিল, যা নির্দেশ করে যে সাইপারমেথ্রিন P. gracilis-এর প্রাকৃতিক আবাসস্থলেও এর জন্য একটি সম্ভাব্য জিনোটক্সিক ঝুঁকি তৈরি করে। মৃত্যুহার বিবেচনায় নিলে, P. gracilis-এর জন্য সহনীয় জেনোবায়োটিক যৌগের সর্বোচ্চ ঘনত্ব ছিল ৪.২৪ μg L−1। তবে, ১ μg/L-এর মতো কম ঘনত্বেও জিনোটক্সিক প্রভাব দেখা গেছে। এই ঘটনাটি অস্বাভাবিক জীবের সংখ্যা বৃদ্ধি করতে পারে এবং তাদের আবাসস্থলে প্রজাতিটির বিকাশ ও প্রজননকে প্রভাবিত করতে পারে, যার ফলে উভচর প্রাণীর সংখ্যা হ্রাস পেতে পারে।
কীটনাশক সাইপারমেথ্রিনের বাণিজ্যিক ফর্মুলেশনগুলো পি. গ্র্যাসিলিসের প্রতি উচ্চ মাত্রার তীব্র এবং দীর্ঘস্থায়ী বিষাক্ততা প্রদর্শন করেছে। উচ্চতর মৃত্যুহার পরিলক্ষিত হয়েছে, যা সম্ভবত বিষাক্ত প্রভাবের কারণে ঘটেছে, যার প্রমাণ হলো মাইক্রোনিউক্লিয়াস এবং লোহিত রক্তকণিকার নিউক্লিয়াসের অস্বাভাবিকতা, বিশেষ করে করাতের মতো খাঁজযুক্ত নিউক্লিয়াস, খণ্ডিত নিউক্লিয়াস এবং থলিযুক্ত নিউক্লিয়াসের উপস্থিতি। এছাড়াও, পরীক্ষিত প্রজাতিটি তীব্র এবং দীর্ঘস্থায়ী উভয় প্রকার বর্ধিত পরিবেশগত ঝুঁকির সম্মুখীন হয়েছে। এই তথ্যগুলো, আমাদের গবেষণা দলের পূর্ববর্তী গবেষণার সাথে একত্রিত করে দেখা গেছে যে, সাইপারমেথ্রিনের বিভিন্ন বাণিজ্যিক ফর্মুলেশনগুলোও পি. গ্র্যাসিলিসের মধ্যে অ্যাসিটাইলকোলিনেস্টারেজ (AChE) এবং বিউটিরাইলকোলিনেস্টারেজ (BChE) এনজাইমের কার্যকারিতা হ্রাস এবং জারণ চাপ সৃষ্টি করে, এবং এর ফলে সাঁতারের কার্যকলাপে পরিবর্তন ও মুখের বিকৃতি ঘটায়, যা ইঙ্গিত করে যে সাইপারমেথ্রিনের বাণিজ্যিক ফর্মুলেশনগুলো এই প্রজাতির জন্য উচ্চ মাত্রার প্রাণঘাতী এবং উপ-প্রাণঘাতী বিষাক্ততা প্রদর্শন করে। হার্টম্যান এট আল। ৬০ নম্বর গবেষণায় দেখা গেছে যে, অন্য নয়টি কীটনাশকের তুলনায় সাইপারমেথ্রিনের বাণিজ্যিক ফর্মুলেশনগুলো পি. গ্র্যাসিলিস এবং একই গণের আরেকটি প্রজাতি (পি. কুভিয়েরি)-এর জন্য সবচেয়ে বিষাক্ত ছিল। এটি থেকে বোঝা যায় যে, পরিবেশ সুরক্ষার জন্য সাইপারমেথ্রিনের আইনসম্মতভাবে অনুমোদিত ঘনত্ব উচ্চ মৃত্যুহার এবং দীর্ঘমেয়াদী জনসংখ্যা হ্রাসের কারণ হতে পারে।
উভচর প্রাণীদের উপর কীটনাশকটির বিষাক্ততা নিরূপণ করার জন্য আরও গবেষণার প্রয়োজন, কারণ পরিবেশে প্রাপ্ত ঘনত্ব উচ্চ মৃত্যুহার ঘটাতে পারে এবং পি. গ্র্যাসিলিস-এর জন্য সম্ভাব্য ঝুঁকি তৈরি করতে পারে। উভচর প্রজাতি নিয়ে গবেষণাকে উৎসাহিত করা উচিত, কারণ এই জীবগুলো সম্পর্কে, বিশেষ করে ব্রাজিলীয় প্রজাতিগুলোর ক্ষেত্রে, তথ্য অপ্রতুল।
দীর্ঘস্থায়ী বিষাক্ততা পরীক্ষাটি স্থির অবস্থায় ১৬৮ ঘন্টা (৭ দিন) ধরে চলেছিল এবং প্রাণঘাতী নয় এমন ঘনত্বগুলো ছিল: ১, ৩, ৬ এবং ২০ μg ai L−1। উভয় পরীক্ষায়, প্রতিটি ট্রিটমেন্ট গ্রুপ থেকে ১০টি করে ব্যাঙাচি ছয়টি পুনরাবৃত্তির মাধ্যমে মূল্যায়ন করা হয়েছিল, অর্থাৎ প্রতিটি ঘনত্বের জন্য মোট ৬০টি ব্যাঙাচি। অন্যদিকে, শুধুমাত্র জলের ট্রিটমেন্টটি একটি নেগেটিভ কন্ট্রোল হিসাবে কাজ করেছিল। প্রতিটি পরীক্ষামূলক সেটআপে ৫০০ মিলি ধারণক্ষমতার একটি জীবাণুমুক্ত কাচের পাত্র এবং প্রতি ৫০ মিলি দ্রবণে ১টি ব্যাঙাচির ঘনত্ব ছিল। বাষ্পীভবন রোধ করার জন্য ফ্লাস্কটি পলিথিন ফিল্ম দিয়ে ঢাকা ছিল এবং এতে ক্রমাগত বায়ু সঞ্চালন করা হতো।
০, ৯৬, এবং ১৬৮ ঘণ্টায় কীটনাশকের ঘনত্ব নির্ধারণের জন্য জলের রাসায়নিক বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। সাবিন এট আল. 68 এবং মার্টিনস এট আল. 69 অনুসারে, ফেডারেল ইউনিভার্সিটি অফ সান্তা মারিয়ার পেস্টিসাইড অ্যানালাইসিস ল্যাবরেটরিতে (LARP) ট্রিপল কোয়াড্রুপল মাস স্পেকট্রোমেট্রির সাথে সংযুক্ত গ্যাস ক্রোমাটোগ্রাফি (ভেরিয়ান মডেল ১২০০, পালো অল্টো, ক্যালিফোর্নিয়া, ইউএসএ) ব্যবহার করে এই বিশ্লেষণগুলি করা হয়েছিল। জলে কীটনাশকের পরিমাণগত নির্ধারণ পরিপূরক উপাদান (টেবিল SM1) হিসাবে দেখানো হয়েছে।
মাইক্রোনিউক্লিয়াস পরীক্ষা (MNT) এবং লোহিত রক্তকণিকার নিউক্লিয়াসের অস্বাভাবিকতা পরীক্ষা (RNA)-এর জন্য, প্রতিটি ট্রিটমেন্ট গ্রুপ থেকে ১৫টি করে ব্যাঙাচি বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। ব্যাঙাচিগুলোকে ৫% লিডোকেইন (৫০ মিলিগ্রাম/গ্রাম) দিয়ে অবেদন দেওয়া হয়েছিল এবং ডিসপোজেবল হেপারিনযুক্ত সিরিঞ্জ ব্যবহার করে কার্ডিয়াক পাংচারের মাধ্যমে রক্তের নমুনা সংগ্রহ করা হয়েছিল। জীবাণুমুক্ত মাইক্রোস্কোপ স্লাইডে রক্তের স্মিয়ার তৈরি করে বাতাসে শুকানো হয়েছিল, ২ মিনিটের জন্য ১০০% মিথানল (৪°সে.) দিয়ে ফিক্স করা হয়েছিল এবং তারপর অন্ধকারে ১৫ মিনিটের জন্য ১০% জিমসা দ্রবণ দিয়ে স্টেইন করা হয়েছিল। প্রক্রিয়া শেষে, অতিরিক্ত স্টেইন অপসারণের জন্য স্লাইডগুলো পাতিত জল দিয়ে ধুয়ে ঘরের তাপমাত্রায় শুকানো হয়েছিল।
প্রতিটি ব্যাঙাচি থেকে কমপক্ষে ১০০০টি লোহিত রক্তকণিকা (RBC) একটি ৭১ অবজেক্টিভসহ ১০০× মাইক্রোস্কোপ ব্যবহার করে MN এবং ENA-এর উপস্থিতি নির্ণয়ের জন্য বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। সাইপারমেথ্রিনের ঘনত্ব এবং কন্ট্রোল বিবেচনা করে ব্যাঙাচি থেকে মোট ৭৫,৭৯৬টি লোহিত রক্তকণিকা মূল্যায়ন করা হয়েছিল। ক্যারাস্কো এট আল. এবং ফেনেচ এট আল.³⁸,⁷²-এর পদ্ধতি অনুসারে নিম্নলিখিত নিউক্লীয় ক্ষতগুলির ফ্রিকোয়েন্সি নির্ধারণ করে জিনোটক্সিসিটি বিশ্লেষণ করা হয়েছিল: (১) অ্যানিউক্লিয়েট কোষ: নিউক্লিয়াসবিহীন কোষ; (২) অ্যাপোপটোটিক কোষ: নিউক্লিয়াসের খণ্ডন, প্রোগ্রামড কোষ মৃত্যু; (৩) বাইনিউক্লিয়েট কোষ: দুটি নিউক্লিয়াসযুক্ত কোষ; (৪) নিউক্লীয় বাড বা ব্লেব কোষ: নিউক্লিয়াসযুক্ত কোষ যার নিউক্লীয় পর্দার ছোট প্রোট্রুশন থাকে, যা মাইক্রোনিউক্লিয়াসের আকারের ব্লেব; (৫) ক্যারিওলাইজড কোষ: কোষ যার কেবল নিউক্লিয়াসের রূপরেখা দেখা যায়, কোনো অভ্যন্তরীণ উপাদান থাকে না; (6) খাঁজযুক্ত কোষ: যে কোষগুলির নিউক্লিয়াসের আকৃতিতে স্পষ্ট ফাটল বা খাঁজ থাকে, একে বৃক্ক-আকৃতির নিউক্লিয়াসও বলা হয়; (7) খণ্ডিত কোষ: যে কোষগুলির নিউক্লিয়াসের প্রোট্রুশন পূর্বোক্ত ভেসিকেলগুলির চেয়ে বড়; এবং (8) মাইক্রোকোষ: যে কোষগুলির নিউক্লিয়াস ঘনীভূত এবং সাইটোপ্লাজম হ্রাসপ্রাপ্ত। পরিবর্তনগুলি নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণের ফলাফলের সাথে তুলনা করা হয়েছিল।
তীব্র বিষাক্ততা পরীক্ষার ফলাফল (LC50) GBasic সফটওয়্যার এবং TSK-Trimmed Spearman-Karber পদ্ধতি74 ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। দীর্ঘস্থায়ী পরীক্ষার ডেটা ত্রুটির স্বাভাবিকতা (Shapiro-Wilks) এবং ভ্যারিয়েন্সের সমরূপতা (Bartlett) এর জন্য পূর্ব-পরীক্ষা করা হয়েছিল। ফলাফলগুলি একমুখী ভ্যারিয়েন্স বিশ্লেষণ (ANOVA) ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। ডেটার নিজেদের মধ্যে তুলনা করার জন্য Tukey's test এবং ট্রিটমেন্ট গ্রুপ ও নেগেটিভ কন্ট্রোল গ্রুপের মধ্যে ডেটা তুলনা করার জন্য Dunnett's test ব্যবহার করা হয়েছিল।
ডানেটের পরীক্ষা ব্যবহার করে LOEC এবং NOEC ডেটা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। ৯৫% তাৎপর্য স্তরে (p < ০.০৫) Statistica 8.0 সফটওয়্যার (StatSoft) ব্যবহার করে পরিসংখ্যানগত পরীক্ষাগুলো সম্পন্ন করা হয়েছিল।