পরিমাণগত গিব্বেরেলিন বায়োসেন্সর অঙ্কুর অ্যাপিক্যাল মেরিস্টেমে ইন্টারনোড স্পেসিফিকেশনে গিব্বেরেলিনের ভূমিকা প্রকাশ করে

কাণ্ডের গঠনের জন্য অঙ্কুরের শীর্ষবিন্দু (SAM) বৃদ্ধি অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ। উদ্ভিদ হরমোনজিব্বেরেলিন(GAs) উদ্ভিদের বৃদ্ধির সমন্বয় সাধনে গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে, কিন্তু SAM-তে তাদের ভূমিকা এখনও সঠিকভাবে বোঝা যায়নি। এখানে, আমরা DELLA প্রোটিনকে ইঞ্জিনিয়ারিং করে GA সিগন্যালিংয়ের একটি রেটিওমেট্রিক বায়োসেন্সর তৈরি করেছি যাতে GA ট্রান্সক্রিপশনাল প্রতিক্রিয়ায় এর অপরিহার্য নিয়ন্ত্রক কার্যকলাপ দমন করা যায় এবং GA স্বীকৃতির সময় এর অবক্ষয় সংরক্ষণ করা যায়। আমরা দেখাই যে এই অবক্ষয়-ভিত্তিক বায়োসেন্সর বিকাশের সময় GA স্তর এবং কোষীয় সংবেদনের পরিবর্তনগুলি সঠিকভাবে রেকর্ড করে। আমরা SAM-তে GA সিগন্যালিং কার্যকলাপ ম্যাপ করার জন্য এই বায়োসেন্সর ব্যবহার করেছি। আমরা দেখাই যে উচ্চ GA সিগন্যালগুলি মূলত অর্গান প্রিমর্ডিয়ার মধ্যে অবস্থিত কোষগুলিতে উপস্থিত থাকে, যা ইন্টারনোড কোষের পূর্বসূরী। লাভ- এবং কার্যকারিতা হ্রাস পদ্ধতি ব্যবহার করে, আমরা আরও দেখাই যে GA কোষ বিভাজন সমতলের ওরিয়েন্টেশন নিয়ন্ত্রণ করে, ইন্টারনোডের ক্যানোনিকাল সেলুলার সংগঠন প্রতিষ্ঠা করে, যার ফলে SAM-তে ইন্টারনোড স্পেসিফিকেশন প্রচার করে।
অঙ্কুর শীর্ষে অবস্থিত অঙ্কুর শীর্ষ মেরিস্টেম (SAM) স্টেম কোষের একটি কুলুঙ্গি ধারণ করে যার কার্যকলাপ উদ্ভিদের জীবনকাল জুড়ে পার্শ্বীয় অঙ্গ এবং কান্ড নোডগুলিকে একটি মডুলার এবং পুনরাবৃত্তিমূলক পদ্ধতিতে তৈরি করে। এই পুনরাবৃত্তিমূলক ইউনিটগুলির প্রতিটি, বা উদ্ভিদ নোডগুলিতে, নোডগুলিতে ইন্টারনোড এবং পার্শ্বীয় অঙ্গ এবং পাতার অক্ষে অক্ষে অক্ষে মেরিস্টেম অন্তর্ভুক্ত থাকে। বিকাশের সময় উদ্ভিদ নোডের বৃদ্ধি এবং সংগঠন পরিবর্তিত হয়। অ্যারাবিডোপসিসে, উদ্ভিদ পর্যায়ে ইন্টারনোডাল বৃদ্ধি দমন করা হয় এবং রোজেট পাতার অক্ষে অক্ষে অক্ষে অক্ষে অক্ষে থাকে। পুষ্পমঞ্জরী পর্যায়ে রূপান্তরের সময়, SAM পুষ্পমঞ্জরী মেরিস্টেমে পরিণত হয়, যা দীর্ঘায়িত ইন্টারনোড এবং অক্ষে কুঁড়ি, কৌলিন পাতার অক্ষে শাখা এবং পরে, পাতাবিহীন ফুল তৈরি করে। যদিও আমরা পাতা, ফুল এবং শাখার সূচনা নিয়ন্ত্রণকারী প্রক্রিয়াগুলি বোঝার ক্ষেত্রে উল্লেখযোগ্য অগ্রগতি করেছি, ইন্টারনোডগুলি কীভাবে উত্থিত হয় সে সম্পর্কে তুলনামূলকভাবে খুব কমই জানা যায়।
GA-এর স্প্যাসিওটেম্পোরাল বন্টন বোঝা বিভিন্ন টিস্যুতে এবং বিভিন্ন বিকাশের পর্যায়ে এই হরমোনগুলির কার্যকারিতা আরও ভালভাবে বুঝতে সাহায্য করবে। নিজস্ব প্রবর্তকের ক্রিয়াকলাপের অধীনে প্রকাশিত RGA-GFP ফিউশনের অবক্ষয়ের ভিজ্যুয়ালাইজেশন মূলগুলিতে মোট GA স্তরের নিয়ন্ত্রণ সম্পর্কে গুরুত্বপূর্ণ তথ্য প্রদান করে15,16। তবে, RGA প্রকাশ টিস্যুতে পরিবর্তিত হয়17 এবং GA18 দ্বারা নিয়ন্ত্রিত হয়। সুতরাং, RGA প্রবর্তকের ডিফারেনশিয়াল প্রকাশের ফলে RGA-GFP-এর সাথে পর্যবেক্ষণ করা প্রতিপ্রভ প্যাটার্ন দেখা যেতে পারে এবং এইভাবে এই পদ্ধতিটি পরিমাণগত নয়। সম্প্রতি, জৈব সক্রিয় ফ্লুরোসেসিন (Fl)-লেবেলযুক্ত GA19,20 মূল এন্ডোকর্টেক্সে GA জমা হওয়া এবং GA পরিবহন দ্বারা এর কোষীয় স্তরের নিয়ন্ত্রণ প্রকাশ করেছে। সম্প্রতি, GA FRET সেন্সর nlsGPS1 দেখিয়েছে যে GA স্তরগুলি মূল, ফিলামেন্ট এবং অন্ধকার-বর্ধিত হাইপোকোটাইলগুলিতে কোষের প্রসারণের সাথে সম্পর্কযুক্ত। তবে, যেমনটি আমরা দেখেছি, GA ঘনত্ব GA সংকেত কার্যকলাপ নিয়ন্ত্রণকারী একমাত্র পরামিতি নয়, কারণ এটি জটিল সংবেদন প্রক্রিয়ার উপর নির্ভর করে। এখানে, DELLA এবং GA সিগন্যালিং পথ সম্পর্কে আমাদের ধারণার উপর ভিত্তি করে, আমরা GA সিগন্যালিং এর জন্য একটি অবক্ষয়-ভিত্তিক রেটিওমেট্রিক বায়োসেন্সরের বিকাশ এবং বৈশিষ্ট্য প্রতিবেদন করি। এই পরিমাণগত বায়োসেন্সর তৈরি করতে, আমরা একটি মিউট্যান্ট GA-সংবেদনশীল RGA ব্যবহার করেছি যা একটি ফ্লুরোসেন্ট প্রোটিনের সাথে মিশে গিয়েছিল এবং টিস্যুতে সর্বব্যাপী প্রকাশিত হয়েছিল, সেইসাথে একটি GA-সংবেদনশীল ফ্লুরোসেন্ট প্রোটিনও ব্যবহার করেছি। আমরা দেখাই যে মিউট্যান্ট RGA প্রোটিন ফিউশনগুলি সর্বব্যাপী প্রকাশিত হলে অন্তঃসত্ত্বা GA সিগন্যালিংয়ে হস্তক্ষেপ করে না এবং এই বায়োসেন্সর উচ্চ স্প্যাটিওটেম্পোরাল রেজোলিউশন সহ সেন্সিং যন্ত্রপাতি দ্বারা GA ইনপুট এবং GA সিগন্যাল প্রক্রিয়াকরণের ফলে সৃষ্ট সিগন্যালিং কার্যকলাপ পরিমাপ করতে পারে। আমরা GA সিগন্যালিং কার্যকলাপের স্প্যাটিওটেম্পোরাল বিতরণ ম্যাপ করতে এবং SAM এপিডার্মিসে GA কীভাবে সেলুলার আচরণ নিয়ন্ত্রণ করে তা পরিমাপ করতে এই বায়োসেন্সর ব্যবহার করেছি। আমরা দেখাই যে GA অঙ্গ প্রিমর্ডিয়ার মধ্যে অবস্থিত SAM কোষের বিভাজন সমতলের ওরিয়েন্টেশন নিয়ন্ত্রণ করে, যার ফলে ইন্টারনোডের ক্যানোনিকাল সেলুলার সংগঠন সংজ্ঞায়িত হয়।
অবশেষে, আমরা জিজ্ঞাসা করলাম যে qmRGA ক্রমবর্ধমান হাইপোকোটাইল ব্যবহার করে এন্ডোজেনাস GA স্তরের পরিবর্তন রিপোর্ট করতে পারে কিনা। আমরা পূর্বে দেখিয়েছি যে নাইট্রেট GA সংশ্লেষণ বৃদ্ধি করে এবং ফলস্বরূপ, DELLA34 অবক্ষয় বৃদ্ধি করে বৃদ্ধিকে উদ্দীপিত করে। সেই অনুযায়ী, আমরা লক্ষ্য করেছি যে প্রচুর নাইট্রেট সরবরাহের (10 mM NO3−) অধীনে জন্মানো pUBQ10::qmRGA চারাগুলিতে হাইপোকোটাইলের দৈর্ঘ্য নাইট্রেট-ঘাটতি পরিস্থিতিতে জন্মানো চারাগুলির তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি ছিল (পরিপূরক চিত্র 6a)। বৃদ্ধির প্রতিক্রিয়ার সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, নাইট্রেটের অনুপস্থিতিতে জন্মানো চারাগুলির তুলনায় 10 mM NO3− অবস্থার অধীনে জন্মানো চারাগুলির হাইপোকোটাইলে GA সংকেত বেশি ছিল (পরিপূরক চিত্র 6b, c)। সুতরাং, qmRGA GA ঘনত্বের এন্ডোজেনাস পরিবর্তন দ্বারা প্ররোচিত GA সংকেতের পরিবর্তনগুলি পর্যবেক্ষণ করতে সক্ষম করে।
সেন্সর ডিজাইনের উপর ভিত্তি করে qmRGA দ্বারা সনাক্ত করা GA সংকেত কার্যকলাপ GA ঘনত্ব এবং GA উপলব্ধির উপর নির্ভর করে কিনা তা বোঝার জন্য, আমরা উদ্ভিজ্জ এবং প্রজনন টিস্যুতে তিনটি GID1 রিসেপ্টরের অভিব্যক্তি বিশ্লেষণ করেছি। চারাগুলিতে, GID1-GUS রিপোর্টার লাইন দেখিয়েছে যে GID1a এবং c কোটিলেডনে উচ্চ মাত্রায় প্রকাশিত হয়েছিল (চিত্র 3a–c)। এছাড়াও, তিনটি রিসেপ্টরই পাতা, পার্শ্বীয় মূল প্রিমর্ডিয়া, মূল টিপস (GID1b এর মূল ক্যাপ ব্যতীত) এবং ভাস্কুলার সিস্টেমে প্রকাশিত হয়েছিল (চিত্র 3a–c)। পুষ্পমঞ্জরী SAM-এ, আমরা শুধুমাত্র GID1b এবং 1c-এর জন্য GUS সংকেত সনাক্ত করেছি (পরিপূরক চিত্র 7a–c)। ইন সিটু হাইব্রিডাইজেশন এই অভিব্যক্তির ধরণগুলি নিশ্চিত করেছে এবং আরও দেখিয়েছে যে GID1c SAM-এর নিম্ন স্তরে সমানভাবে প্রকাশিত হয়েছিল, যেখানে GID1b SAM-এর পরিধিতে উচ্চতর অভিব্যক্তি দেখিয়েছে (পরিপূরক চিত্র 7d–l)। pGID1b::2xmTQ2-GID1b ট্রান্সলেশনাল ফিউশন GID1b এক্সপ্রেশনের একটি গ্রেডেড পরিসরও প্রকাশ করেছে, SAM-এর কেন্দ্রে কম বা কোনও এক্সপ্রেশন থেকে শুরু করে অঙ্গ সীমানায় উচ্চ এক্সপ্রেশন পর্যন্ত (পরিপূরক চিত্র 7m)। সুতরাং, GID1 রিসেপ্টরগুলি টিস্যু জুড়ে এবং ভিতরে সমানভাবে বিতরণ করা হয় না। পরবর্তী পরীক্ষায়, আমরা আরও লক্ষ্য করেছি যে GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) এর অত্যধিক এক্সপ্রেশন হাইপোকোটাইলগুলিতে বাহ্যিক GA প্রয়োগের প্রতি qmRGA-এর সংবেদনশীলতা বৃদ্ধি করেছে (চিত্র 3d, e)। বিপরীতে, হাইপোকোটাইলে qd17mRGA দ্বারা পরিমাপ করা প্রতিপ্রভতা GA3 চিকিত্সার প্রতি সংবেদনশীল ছিল না (চিত্র 3f, g)। উভয় পরীক্ষার জন্য, সেন্সরের দ্রুত আচরণ মূল্যায়ন করার জন্য চারাগুলিকে GA (100 μM GA3) এর উচ্চ ঘনত্ব দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল, যেখানে GID1 রিসেপ্টরের সাথে আবদ্ধ হওয়ার ক্ষমতা বৃদ্ধি বা হারিয়ে গিয়েছিল। একসাথে, এই ফলাফলগুলি নিশ্চিত করে যে qmRGA বায়োসেন্সর একটি GA এবং GA সেন্সর হিসাবে একটি সম্মিলিত ফাংশন পরিবেশন করে এবং পরামর্শ দেয় যে GID1 রিসেপ্টরের ডিফারেনশিয়াল এক্সপ্রেশন সেন্সরের নির্গমনকে উল্লেখযোগ্যভাবে পরিবর্তন করতে পারে।
আজ অবধি, SAM-তে GA সংকেতের বন্টন অস্পষ্ট রয়ে গেছে। অতএব, আমরা qmRGA-প্রকাশকারী উদ্ভিদ এবং pCLV3::mCherry-NLS স্টেম সেল রিপোর্টার35 ব্যবহার করে GA সংকেত কার্যকলাপের উচ্চ-রেজোলিউশন পরিমাণগত মানচিত্র গণনা করেছি, L1 স্তরের উপর দৃষ্টি নিবদ্ধ করে (এপিডার্মিস; চিত্র 4a, b, পদ্ধতি এবং পরিপূরক পদ্ধতি দেখুন), যেহেতু L1 SAM বৃদ্ধি নিয়ন্ত্রণে গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে36। এখানে, pCLV3::mCherry-NLS অভিব্যক্তি GA সংকেত কার্যকলাপের স্থানিক-টেম্পোরাল বিতরণ বিশ্লেষণের জন্য একটি নির্দিষ্ট জ্যামিতিক রেফারেন্স বিন্দু প্রদান করেছে37। যদিও GA পার্শ্বীয় অঙ্গ বিকাশের জন্য অপরিহার্য বলে বিবেচিত হয়4, আমরা লক্ষ্য করেছি যে P3 পর্যায় থেকে শুরু করে ফুলের প্রাইমর্ডিয়াম (P) তে GA সংকেত কম ছিল (চিত্র 4a, b), যেখানে তরুণ P1 এবং P2 প্রাইমর্ডিয়ামগুলির কেন্দ্রীয় অঞ্চলের মতো মাঝারি কার্যকলাপ ছিল (চিত্র 4a, b)। অর্গান প্রিমর্ডিয়াম সীমানায় উচ্চতর GA সংকেত কার্যকলাপ সনাক্ত করা হয়েছিল, যা P1/P2 (সীমানার পাশে) থেকে শুরু হয়ে P4-তে শীর্ষে পৌঁছেছিল, সেইসাথে প্রিমর্ডিয়ার মধ্যে অবস্থিত পেরিফেরাল অঞ্চলের সমস্ত কোষে (চিত্র 4a, b এবং পরিপূরক চিত্র 8a, b)। এই উচ্চতর GA সংকেত কার্যকলাপ কেবল এপিডার্মিসেই নয়, L2 এবং উপরের L3 স্তরেও পরিলক্ষিত হয়েছিল (পরিপূরক চিত্র 8b)। qmRGA ব্যবহার করে SAM-তে সনাক্ত করা GA সংকেতের ধরণটিও সময়ের সাথে সাথে অপরিবর্তিত ছিল (পরিপূরক চিত্র 8c–f, k)। যদিও আমরা বিস্তারিতভাবে চিহ্নিত পাঁচটি স্বাধীন রেখা থেকে T3 উদ্ভিদের SAM-তে qd17mRGA গঠন পদ্ধতিগতভাবে হ্রাস পেয়েছিল, আমরা pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP গঠনের মাধ্যমে প্রাপ্ত প্রতিপ্রভ ধরণগুলি বিশ্লেষণ করতে সক্ষম হয়েছি (পরিপূরক চিত্র 8g–j, l)। এই নিয়ন্ত্রণ রেখায়, SAM-তে ফ্লুরোসেন্স অনুপাতের কেবলমাত্র সামান্য পরিবর্তন সনাক্ত করা হয়েছে, কিন্তু SAM কেন্দ্রে আমরা TagBFP-এর সাথে সম্পর্কিত VENUS-এর একটি স্পষ্ট এবং অপ্রত্যাশিত হ্রাস লক্ষ্য করেছি। এটি নিশ্চিত করে যে qmRGA দ্বারা পর্যবেক্ষণ করা সিগন্যালিং প্যাটার্ন mRGA-VENUS-এর GA-নির্ভর অবক্ষয়কে প্রতিফলিত করে, তবে এটিও প্রমাণ করে যে qmRGA মেরিস্টেম কেন্দ্রে GA সিগন্যালিং কার্যকলাপকে অতিরঞ্জিত করতে পারে। সংক্ষেপে, আমাদের ফলাফলগুলি একটি GA সিগন্যালিং প্যাটার্ন প্রকাশ করে যা প্রাথমিকভাবে প্রিমর্ডিয়ার বিতরণকে প্রতিফলিত করে। আন্তঃ-প্রাইমর্ডিয়াল অঞ্চলের (IPR) এই বন্টনটি বিকাশমান প্রিমর্ডিয়াম এবং কেন্দ্রীয় অঞ্চলের মধ্যে উচ্চ GA সিগন্যালিং কার্যকলাপ ধীরে ধীরে প্রতিষ্ঠার কারণে ঘটে, একই সময়ে প্রিমর্ডিয়ামে GA সিগন্যালিং কার্যকলাপ হ্রাস পায় (চিত্র 4c, d)।
GID1b এবং GID1c রিসেপ্টরের বন্টন (উপরে দেখুন) ইঙ্গিত দেয় যে GA রিসেপ্টরের ডিফারেনশিয়াল এক্সপ্রেশন SAM-তে GA সিগন্যালিং কার্যকলাপের ধরণ গঠনে সহায়তা করে। আমরা ভাবছিলাম যে GA-এর ডিফারেনশিয়াল জমা হতে পারে কিনা। এই সম্ভাবনাটি তদন্ত করার জন্য, আমরা nlsGPS1 GA FRET সেন্সর 21 ব্যবহার করেছি। 100 মিনিটের জন্য 10 μM GA4+7 দিয়ে চিকিত্সা করা nlsGPS1-এর SAM-তে বর্ধিত অ্যাক্টিভেশন ফ্রিকোয়েন্সি সনাক্ত করা হয়েছে (পরিপূরক চিত্র 9a–e), যা নির্দেশ করে যে nlsGPS1 SAM-তে GA ঘনত্বের পরিবর্তনের প্রতি সাড়া দেয়, যেমনটি রুট 21-তে করে। nlsGPS1 অ্যাক্টিভেশন ফ্রিকোয়েন্সির স্থানিক বন্টন SAM-এর বাইরের স্তরগুলিতে তুলনামূলকভাবে কম GA স্তর প্রকাশ করেছে, তবে দেখিয়েছে যে তারা কেন্দ্রে এবং SAM-এর সীমানায় উন্নত ছিল (চিত্র 4e এবং পরিপূরক চিত্র 9a,c)। এটি ইঙ্গিত দেয় যে GA SAM-তেও বিতরণ করা হয়েছে একটি স্থানিক প্যাটার্নের সাথে যা qmRGA দ্বারা প্রকাশিত হয়। একটি পরিপূরক পদ্ধতি হিসেবে, আমরা SAM-কে ফ্লুরোসেন্ট GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) অথবা শুধুমাত্র Fl-এর মাধ্যমে নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ হিসেবে বিবেচনা করেছি। Fl সংকেতটি কেন্দ্রীয় অঞ্চল এবং প্রাইমর্ডিয়াম সহ SAM জুড়ে বিতরণ করা হয়েছিল, যদিও তীব্রতা কম ছিল (চিত্র 4j এবং পরিপূরক চিত্র 10d)। বিপরীতে, তিনটি GA-Flই বিশেষভাবে প্রাইমর্ডিয়াম সীমানার মধ্যে এবং IPR-এর বাকি অংশে বিভিন্ন মাত্রায় জমা হয়েছিল, যেখানে GA7-Fl IPR-এর বৃহত্তম ডোমেনে জমা হয়েছিল (চিত্র 4k এবং পরিপূরক চিত্র 10a,b)। ফ্লুরোসেন্স তীব্রতার পরিমাণ নির্ধারণে দেখা গেছে যে Fl-চিকিৎসা করা SAM-এর তুলনায় GA-Fl-চিকিৎসা করা SAM-তে IPR থেকে নন-IPR তীব্রতা অনুপাত বেশি ছিল (চিত্র 4l এবং পরিপূরক চিত্র 10c)। একসাথে, এই ফলাফলগুলি ইঙ্গিত দেয় যে GA অঙ্গ সীমানার সবচেয়ে কাছে অবস্থিত IPR কোষগুলিতে উচ্চ ঘনত্বে উপস্থিত রয়েছে। এটি ইঙ্গিত দেয় যে SAM GA সংকেত কার্যকলাপের ধরণটি GA রিসেপ্টরগুলির ডিফারেনশিয়াল এক্সপ্রেশন এবং অঙ্গ সীমানার কাছাকাছি IPR কোষগুলিতে GA এর ডিফারেনশিয়াল জমা উভয়ের ফলেই ঘটে। সুতরাং, আমাদের বিশ্লেষণে GA সংকেতের একটি অপ্রত্যাশিত স্থানিক-অস্থায়ী ধরণ প্রকাশিত হয়েছে, যেখানে SAM এর কেন্দ্র এবং আদিম অঞ্চলে কম কার্যকলাপ এবং পেরিফেরাল অঞ্চলে IPR-তে উচ্চ কার্যকলাপ রয়েছে।
SAM-তে ডিফারেনশিয়াল GA সিগন্যালিং কার্যকলাপের ভূমিকা বোঝার জন্য, আমরা SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS-এর রিয়েল-টাইম টাইম-ল্যাপস ইমেজিং ব্যবহার করে GA সিগন্যালিং কার্যকলাপ, কোষ সম্প্রসারণ এবং কোষ বিভাজনের মধ্যে পারস্পরিক সম্পর্ক বিশ্লেষণ করেছি। বৃদ্ধি নিয়ন্ত্রণে GA-এর ভূমিকা বিবেচনা করে, কোষ সম্প্রসারণ পরামিতিগুলির সাথে একটি ইতিবাচক সম্পর্ক প্রত্যাশিত ছিল। অতএব, আমরা প্রথমে GA সিগন্যালিং কার্যকলাপ মানচিত্রগুলিকে কোষ পৃষ্ঠের বৃদ্ধির হারের মানচিত্রের সাথে তুলনা করেছি (একটি নির্দিষ্ট কোষের জন্য এবং বিভাজনের সময় কন্যা কোষের জন্য কোষ সম্প্রসারণের শক্তির জন্য একটি প্রক্সি হিসাবে) এবং বৃদ্ধির অ্যানিসোট্রপির মানচিত্রের সাথে, যা কোষ সম্প্রসারণের দিকনির্দেশনা পরিমাপ করে (এখানে একটি নির্দিষ্ট কোষের জন্য এবং বিভাগে কন্যা কোষের জন্যও ব্যবহৃত হয়েছে; চিত্র 5a, b, পদ্ধতি এবং পরিপূরক পদ্ধতি দেখুন)। SAM কোষ পৃষ্ঠের বৃদ্ধির হারের আমাদের মানচিত্রগুলি পূর্ববর্তী পর্যবেক্ষণগুলির সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ 38,39, সীমানায় ন্যূনতম বৃদ্ধির হার এবং বিকাশমান ফুলগুলিতে সর্বাধিক বৃদ্ধির হার (চিত্র 5a)। প্রধান উপাদান বিশ্লেষণ (PCA) দেখিয়েছে যে GA সিগন্যালিং কার্যকলাপ কোষ পৃষ্ঠের বৃদ্ধির তীব্রতার সাথে নেতিবাচকভাবে সম্পর্কিত ছিল (চিত্র 5c)। আমরা আরও দেখিয়েছি যে GA সিগন্যালিং ইনপুট এবং বৃদ্ধির তীব্রতা সহ পরিবর্তনের প্রধান অক্ষগুলি উচ্চ CLV3 এক্সপ্রেশন দ্বারা নির্ধারিত দিকের সাথে অরথোগোনাল ছিল, যা অবশিষ্ট বিশ্লেষণগুলিতে SAM কেন্দ্র থেকে কোষগুলিকে বাদ দেওয়ার বিষয়টি নিশ্চিত করে। স্পিয়ারম্যান পারস্পরিক সম্পর্ক বিশ্লেষণ PCA ফলাফল (চিত্র 5d) নিশ্চিত করেছে, যা ইঙ্গিত করে যে IPR-তে উচ্চতর GA সংকেত উচ্চতর কোষ সম্প্রসারণের ফলে হয়নি। যাইহোক, পারস্পরিক সম্পর্ক বিশ্লেষণ GA সংকেত কার্যকলাপ এবং বৃদ্ধি অ্যানিসোট্রপির মধ্যে সামান্য ইতিবাচক সম্পর্ক প্রকাশ করেছে (চিত্র 5c, d), যা পরামর্শ দেয় যে IPR-তে উচ্চতর GA সংকেত কোষ বৃদ্ধির দিক এবং সম্ভবত কোষ বিভাজন সমতলের অবস্থানকে প্রভাবিত করে।
a, b SAM-তে গড় পৃষ্ঠের বৃদ্ধি (a) এবং বৃদ্ধি অ্যানিসোট্রপি (b) এর তাপ মানচিত্র গড়ে সাতটি স্বাধীন উদ্ভিদের উপর (যথাক্রমে কোষ সম্প্রসারণের শক্তি এবং দিকের জন্য প্রক্সি হিসাবে ব্যবহৃত হয়)। c PCA বিশ্লেষণে নিম্নলিখিত ভেরিয়েবলগুলি অন্তর্ভুক্ত ছিল: GA সংকেত, পৃষ্ঠের বৃদ্ধির তীব্রতা, পৃষ্ঠের বৃদ্ধি অ্যানিসোট্রপি এবং CLV3 এক্সপ্রেশন। PCA উপাদান 1 মূলত পৃষ্ঠের বৃদ্ধির তীব্রতার সাথে নেতিবাচকভাবে সম্পর্কযুক্ত ছিল এবং GA সংকেতের সাথে ইতিবাচকভাবে সম্পর্কযুক্ত ছিল। PCA উপাদান 2 মূলত পৃষ্ঠের বৃদ্ধি অ্যানিসোট্রপির সাথে ইতিবাচকভাবে সম্পর্কযুক্ত ছিল এবং CLV3 এক্সপ্রেশনের সাথে নেতিবাচকভাবে সম্পর্কযুক্ত ছিল। শতাংশ প্রতিটি উপাদান দ্বারা ব্যাখ্যা করা পরিবর্তনকে প্রতিনিধিত্ব করে। d CZ বাদে টিস্যু স্কেলে GA সংকেত, পৃষ্ঠের বৃদ্ধির তীব্রতা এবং পৃষ্ঠের বৃদ্ধি অ্যানিসোট্রপির মধ্যে স্পিয়ারম্যান পারস্পরিক সম্পর্ক বিশ্লেষণ। ডানদিকের সংখ্যাটি দুটি ভেরিয়েবলের মধ্যে স্পিয়ারম্যান rho মান। তারকাচিহ্নগুলি এমন ক্ষেত্রে নির্দেশ করে যেখানে পারস্পরিক সম্পর্ক/নেতিবাচক পারস্পরিক সম্পর্ক অত্যন্ত তাৎপর্যপূর্ণ। e কনফোকাল মাইক্রোস্কোপি দ্বারা Col-0 SAM L1 কোষের 3D ভিজ্যুয়ালাইজেশন। ১০ ঘন্টায় SAM-তে (কিন্তু প্রিমর্ডিয়াম নয়) গঠিত নতুন কোষ প্রাচীরগুলি তাদের কোণ মান অনুসারে রঙ করা হয়। রঙের বারটি নীচের ডান কোণে দেখানো হয়েছে। ইনসেটটি ০ ঘন্টায় সংশ্লিষ্ট 3D চিত্র দেখায়। একই ফলাফল সহ পরীক্ষাটি দুবার পুনরাবৃত্তি করা হয়েছিল। f বাক্স প্লটগুলি IPR এবং নন-IPR Col-0 SAM (n = ১০টি স্বাধীন উদ্ভিদ) তে কোষ বিভাজনের হার প্রদর্শন করে। কেন্দ্র রেখাটি মধ্যমা দেখায় এবং বাক্সের সীমানা ২৫তম এবং ৭৫তম শতাংশ নির্দেশ করে। হুইস্কারগুলি R সফ্টওয়্যার দিয়ে নির্ধারিত সর্বনিম্ন এবং সর্বাধিক মান নির্দেশ করে। P মানগুলি ওয়েলচের দ্বি-পুচ্ছ টি-পরীক্ষার মাধ্যমে প্রাপ্ত হয়েছিল। g, h স্কিম্যাটিক ডায়াগ্রাম দেখায় (g) SAM (সাদা বিন্দুযুক্ত রেখা) কেন্দ্র থেকে রেডিয়াল দিকের সাপেক্ষে নতুন কোষ প্রাচীরের (ম্যাজেন্টা) কোণ কীভাবে পরিমাপ করতে হয় (শুধুমাত্র তীব্র কোণ মান, অর্থাৎ, 0-90°, বিবেচনা করা হয়), এবং (h) মেরিস্টেমের মধ্যে পরিধি/পার্শ্বীয় এবং রেডিয়াল দিকনির্দেশনা। i যথাক্রমে SAM (গাঢ় নীল), IPR (মাঝারি নীল) এবং নন-IPR (হালকা নীল) জুড়ে কোষ বিভাজন সমতল অভিযোজনের ফ্রিকোয়েন্সি হিস্টোগ্রাম। দ্বি-লেজযুক্ত কলমোগোরভ-স্মিরনভ পরীক্ষার মাধ্যমে P মানগুলি পাওয়া গেছে। একই ফলাফলের সাথে পরীক্ষাটি দুবার পুনরাবৃত্তি করা হয়েছে। j যথাক্রমে P3 (হালকা সবুজ), P4 (মাঝারি সবুজ) এবং P5 (গাঢ় সবুজ) এর আশেপাশে IPR এর কোষ বিভাজন সমতল অভিযোজনের ফ্রিকোয়েন্সি হিস্টোগ্রাম। দ্বি-লেজযুক্ত কলমোগোরভ-স্মিরনভ পরীক্ষার মাধ্যমে P মানগুলি পাওয়া গেছে। একই ফলাফলের সাথে পরীক্ষাটি দুবার পুনরাবৃত্তি করা হয়েছে।
অতএব, আমরা পরবর্তীতে পরীক্ষা চলাকালীন নবগঠিত কোষ প্রাচীর সনাক্ত করে GA সংকেত এবং কোষ বিভাজন কার্যকলাপের মধ্যে পারস্পরিক সম্পর্ক অনুসন্ধান করেছি (চিত্র 5e)। এই পদ্ধতির মাধ্যমে আমরা কোষ বিভাজনের ফ্রিকোয়েন্সি এবং দিক পরিমাপ করতে পেরেছি। আশ্চর্যজনকভাবে, আমরা দেখতে পেয়েছি যে IPR এবং SAM-এর বাকি অংশে (নন-IPR, চিত্র 5f) কোষ বিভাজনের ফ্রিকোয়েন্সি একই রকম ছিল, যা ইঙ্গিত করে যে IPR এবং নন-IPR কোষের মধ্যে GA সংকেতের পার্থক্য কোষ বিভাজনকে উল্লেখযোগ্যভাবে প্রভাবিত করে না। এটি এবং GA সংকেত এবং বৃদ্ধি অ্যানিসোট্রপির মধ্যে ইতিবাচক সম্পর্ক, আমাদের বিবেচনা করতে প্ররোচিত করেছে যে GA সংকেত কার্যকলাপ কোষ বিভাজন সমতলের অভিযোজনকে প্রভাবিত করতে পারে কিনা। আমরা মেরিস্টেম কেন্দ্র এবং নতুন কোষ প্রাচীরের কেন্দ্রকে সংযুক্তকারী রেডিয়াল অক্ষের সাপেক্ষে একটি তীক্ষ্ণ কোণ হিসাবে নতুন কোষ প্রাচীরের অভিযোজন পরিমাপ করেছি (চিত্র 5e-i) এবং রেডিয়াল অক্ষের সাপেক্ষে 90° এর কাছাকাছি কোণে কোষগুলির বিভাজনের একটি স্পষ্ট প্রবণতা লক্ষ্য করেছি, সর্বোচ্চ ফ্রিকোয়েন্সি 70-80° (23.28%) এবং 80-90° (22.62%) (চিত্র 5e,i) এ পরিধি/ট্রান্সভার্স দিকে কোষ বিভাজনের সাথে সম্পর্কিত (চিত্র 5h)। এই কোষ বিভাজন আচরণে GA সংকেতের অবদান পরীক্ষা করার জন্য, আমরা IPR এবং নন-IPR-তে কোষ বিভাজনের পরামিতিগুলি পৃথকভাবে বিশ্লেষণ করেছি (চিত্র 5i)। আমরা লক্ষ্য করেছি যে IPR কোষগুলিতে বিভাজন কোণ বিতরণ অ-IPR কোষগুলিতে বা সমগ্র SAM-এর কোষগুলিতে থেকে ভিন্ন ছিল, যেখানে IPR কোষগুলিতে পার্শ্বীয়/বৃত্তাকার কোষ বিভাজনের উচ্চ অনুপাত দেখা গেছে, অর্থাৎ, 70-80° এবং 80-90° (যথাক্রমে 33.86% এবং 30.71%, সংশ্লিষ্ট অনুপাত) (চিত্র 5i)। সুতরাং, আমাদের পর্যবেক্ষণগুলি উচ্চ GA সংকেত এবং পরিধির দিকের কাছাকাছি একটি কোষ বিভাজন সমতল অভিযোজনের মধ্যে একটি সম্পর্ক প্রকাশ করেছে, যা GA সংকেত কার্যকলাপ এবং বৃদ্ধি অ্যানিসোট্রপির মধ্যে পারস্পরিক সম্পর্কের অনুরূপ (চিত্র 5c, d)। এই সংযোগের স্থানিক সংরক্ষণ আরও প্রতিষ্ঠিত করার জন্য, আমরা P3 থেকে শুরু করে প্রাইমর্ডিয়ামের চারপাশে IPR কোষগুলিতে বিভাজন সমতল অভিযোজন পরিমাপ করেছি, যেহেতু P4 থেকে শুরু করে এই অঞ্চলে সর্বোচ্চ GA সংকেত কার্যকলাপ সনাক্ত করা হয়েছিল (চিত্র 4)। P3 এবং P4 এর চারপাশে IPR এর বিভাজন কোণগুলি কোনও পরিসংখ্যানগতভাবে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য দেখায়নি, যদিও P4 এর চারপাশে IPR-তে পার্শ্বীয় কোষ বিভাজনের বর্ধিত ফ্রিকোয়েন্সি পরিলক্ষিত হয়েছিল (চিত্র 5j)। তবে, P5 এর আশেপাশের IPR কোষগুলিতে, কোষ বিভাজন সমতলের ওরিয়েন্টেশনের পার্থক্য পরিসংখ্যানগতভাবে তাৎপর্যপূর্ণ হয়ে ওঠে, ট্রান্সভার্স কোষ বিভাজনের ফ্রিকোয়েন্সিতে তীব্র বৃদ্ধির সাথে (চিত্র 5j)। একসাথে, এই ফলাফলগুলি ইঙ্গিত দেয় যে GA সিগন্যালিং SAM-তে কোষ বিভাজনের ওরিয়েন্টেশন নিয়ন্ত্রণ করতে পারে, যা পূর্ববর্তী প্রতিবেদনগুলির সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ 40,41 যে উচ্চ GA সিগন্যালিং IPR-তে কোষ বিভাজনের পার্শ্বীয় ওরিয়েন্টেশনকে প্ররোচিত করতে পারে।
পূর্বাভাস দেওয়া হয়েছে যে IPR-এর কোষগুলি প্রাইমর্ডিয়ায় নয় বরং ইন্টারনোডে অন্তর্ভুক্ত হবে2,42,43। IPR-তে কোষ বিভাজনের ট্রান্সভার্স ওরিয়েন্টেশনের ফলে ইন্টারনোডে এপিডার্মাল কোষগুলির সমান্তরাল অনুদৈর্ঘ্য সারির একটি সাধারণ সংগঠন তৈরি হতে পারে। উপরে বর্ণিত আমাদের পর্যবেক্ষণগুলি থেকে বোঝা যায় যে GA সিগন্যালিং সম্ভবত কোষ বিভাজনের দিক নিয়ন্ত্রণ করে এই প্রক্রিয়ায় ভূমিকা পালন করে।
বেশ কয়েকটি DELLA জিনের কার্যকারিতা হ্রাসের ফলে একটি গঠনমূলক GA প্রতিক্রিয়া দেখা দেয় এবং এই অনুমান পরীক্ষা করার জন্য della মিউট্যান্ট ব্যবহার করা যেতে পারে44। আমরা প্রথমে SAM-তে পাঁচটি DELLA জিনের প্রকাশের ধরণ বিশ্লেষণ করেছি। GUS লাইন45-এর ট্রান্সক্রিপশনাল ফিউশন থেকে জানা গেছে যে GAI, RGA, RGL1, এবং RGL2 (অনেক কম পরিমাণে) SAM-তে প্রকাশ করা হয়েছে (পরিপূরক চিত্র 11a–d)। ইন সিটু হাইব্রিডাইজেশন আরও দেখিয়েছে যে GAI mRNA বিশেষভাবে প্রিমোর্ডিয়া এবং বিকাশমান ফুলে জমা হয় (পরিপূরক চিত্র 11e)। RGL1 এবং RGL3 mRNA SAM ক্যানোপি জুড়ে এবং পুরানো ফুলগুলিতে সনাক্ত করা হয়েছিল, যেখানে RGL2 mRNA সীমান্ত অঞ্চলে বেশি ছিল (পরিপূরক চিত্র 11f–h)। pRGL3::RGL3-GFP SAM-এর কনফোকাল ইমেজিং ইন সিটু হাইব্রিডাইজেশন দ্বারা পর্যবেক্ষণ করা অভিব্যক্তি নিশ্চিত করেছে এবং দেখিয়েছে যে RGL3 প্রোটিন SAM-এর কেন্দ্রীয় অংশে জমা হয় (পরিপূরক চিত্র 11i)। pRGA::GFP-RGA লাইন ব্যবহার করে, আমরা আরও দেখতে পেলাম যে SAM-তে RGA প্রোটিন জমা হয়, কিন্তু P4 থেকে শুরু করে সীমানায় এর প্রাচুর্য হ্রাস পায় (পরিপূরক চিত্র 11j)। উল্লেখযোগ্যভাবে, RGL3 এবং RGA-এর এক্সপ্রেশন প্যাটার্নগুলি IPR-তে উচ্চতর GA সিগন্যালিং কার্যকলাপের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, যেমনটি qmRGA (চিত্র 4) দ্বারা সনাক্ত করা হয়েছে। অধিকন্তু, এই তথ্যগুলি নির্দেশ করে যে সমস্ত DELLA SAM-তে প্রকাশিত হয় এবং তাদের এক্সপ্রেশন সম্মিলিতভাবে সমগ্র SAM জুড়ে বিস্তৃত।
এরপর আমরা বন্য-প্রকার SAM (Ler, নিয়ন্ত্রণ) এবং gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (গ্লোবাল) মিউট্যান্টের কোষ বিভাজনের পরামিতি বিশ্লেষণ করেছি (চিত্র 6a, b)। মজার বিষয় হল, আমরা বন্য প্রকারের (চিত্র 6c) তুলনায় della global mutant SAM-তে কোষ বিভাজন কোণ ফ্রিকোয়েন্সি বিতরণে একটি পরিসংখ্যানগতভাবে উল্লেখযোগ্য পরিবর্তন লক্ষ্য করেছি। della global mutant-এর এই পরিবর্তনটি 80-90° কোণ (34.71% বনাম 24.55%) এবং কিছুটা কম পরিমাণে 70-80° কোণ (23.78% বনাম 20.18%) এর ফ্রিকোয়েন্সি বৃদ্ধির কারণে হয়েছিল, অর্থাৎ, ট্রান্সভার্স কোষ বিভাজনের সাথে সম্পর্কিত (চিত্র 6c)। নন-ট্রান্সভার্স বিভাজনের ফ্রিকোয়েন্সি (0-60°) ডেলা গ্লোবাল মিউট্যান্টেও কম ছিল (চিত্র 6c)। ডেলা গ্লোবাল মিউট্যান্টের SAM-তে ট্রান্সভার্স কোষ বিভাজনের ফ্রিকোয়েন্সি উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছিল (চিত্র 6b)। ডেলা গ্লোবাল মিউট্যান্টের IPR-তে ট্রান্সভার্স কোষ বিভাজনের ফ্রিকোয়েন্সিও বন্য ধরণের (চিত্র 6d) তুলনায় বেশি ছিল। IPR অঞ্চলের বাইরে, বন্য ধরণের কোষ বিভাজন কোণগুলির আরও অভিন্ন বন্টন ছিল, যেখানে ডেলা গ্লোবাল মিউট্যান্ট IPR (চিত্র 6e) এর মতো স্পর্শক বিভাজন পছন্দ করত। আমরা ga2 অক্সিডেস (ga2ox) কুইন্টুপল মিউট্যান্ট (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, এবং ga2ox6-2) এর SAM-তে কোষ বিভাজনের ওরিয়েন্টেশনের পরিমাণও পরিমাপ করেছি, একটি GA-নিষ্ক্রিয় মিউট্যান্ট পটভূমি যেখানে GA জমা হয়। GA স্তর বৃদ্ধির সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, quintuple ga2ox মিউট্যান্ট ইনফ্লোরেসেন্সের SAM Col-0 (পরিপূরক চিত্র 12a, b) এর চেয়ে বড় ছিল এবং Col-0 এর তুলনায়, quintuple ga2ox SAM কোষ বিভাজন কোণের একটি স্পষ্টভাবে ভিন্ন বন্টন দেখিয়েছে, কোণ ফ্রিকোয়েন্সি 50° থেকে 90° পর্যন্ত বৃদ্ধি পেয়েছে, অর্থাৎ আবার স্পর্শক বিভাজনের পক্ষে (পরিপূরক চিত্র 12a–c)। সুতরাং, আমরা দেখাই যে GA সংকেতের গঠনমূলক সক্রিয়করণ এবং GA সঞ্চয় IPR এবং SAM এর বাকি অংশে পার্শ্বীয় কোষ বিভাজনকে প্ররোচিত করে।
a, b কনফোকাল মাইক্রোস্কোপি ব্যবহার করে PI-স্টেইন্ড Ler (a) এবং গ্লোবাল ডেলা মিউট্যান্ট (b) SAM-এর L1 স্তরের 3D ভিজ্যুয়ালাইজেশন। 10-ঘন্টা সময়কালে SAM-তে (কিন্তু প্রিমর্ডিয়াম নয়) গঠিত নতুন কোষ প্রাচীরগুলি তাদের কোণ মান অনুসারে দেখানো এবং রঙ করা হয়েছে। ইনসেটটি 0 ঘন্টায় SAM দেখায়। রঙের বারটি নীচের ডান কোণে প্রদর্শিত হয়। (b) এর তীরটি গ্লোবাল ডেলা মিউট্যান্টে সারিবদ্ধ কোষ ফাইলগুলির একটি উদাহরণ নির্দেশ করে। একই ফলাফলের সাথে পরীক্ষাটি দুবার পুনরাবৃত্তি করা হয়েছিল। ce Ler এবং গ্লোবাল ডেলার মধ্যে সমগ্র SAM (d), IPR (e), এবং নন-IPR (f)-এ কোষ বিভাজন সমতল ওরিয়েন্টেশনের ফ্রিকোয়েন্সি বিতরণের তুলনা। P মানগুলি একটি দ্বি-লেজযুক্ত কলমোগোরভ-স্মিরনভ পরীক্ষা ব্যবহার করে প্রাপ্ত করা হয়েছিল। f, g কল-0 (i) এবং pCUC2::gai-1-VENUS (j) ট্রান্সজেনিক উদ্ভিদের PI-স্টেইন্ড SAM-এর কনফোকাল চিত্রগুলির 3D ভিজ্যুয়ালাইজেশন। প্যানেল (a, b) 10 ঘন্টার মধ্যে SAM-তে নতুন কোষ প্রাচীর (কিন্তু আদিম নয়) তৈরি দেখায়। পরীক্ষাটি দুবার পুনরাবৃত্তি করা হয়েছিল এবং একই ফলাফল পাওয়া গেছে। h–j Col-0 এবং pCUC2::gai-1-VENUS উদ্ভিদের মধ্যে সমগ্র SAM (h), IPR (i) এবং নন-IPR (j) তে অবস্থিত কোষ বিভাজন সমতল অভিযোজনের ফ্রিকোয়েন্সি বন্টনের তুলনা। P মানগুলি একটি দ্বি-লেজযুক্ত Kolmogorov-Smirnov পরীক্ষা ব্যবহার করে প্রাপ্ত করা হয়েছিল।
আমরা পরবর্তীতে IPR-তে বিশেষভাবে GA সিগন্যালিং বাধাদানের প্রভাব পরীক্ষা করেছিলাম। এই লক্ষ্যে, আমরা VENUS-এর সাথে সংযুক্ত একটি প্রভাবশালী নেতিবাচক gai-1 প্রোটিনের অভিব্যক্তি চালনা করার জন্য cotyledon cup 2 (CUC2) প্রমোটার ব্যবহার করেছি (pCUC2::gai-1-VENUS লাইনে)। বন্য-প্রকার SAM-তে, CUC2 প্রমোটার P4 থেকে SAM-এর বেশিরভাগ IPR-এর অভিব্যক্তি চালায়, যার মধ্যে সীমানা কোষও অন্তর্ভুক্ত, এবং pCUC2::gai-1-VENUS উদ্ভিদেও একই রকম নির্দিষ্ট অভিব্যক্তি পরিলক্ষিত হয়েছে (নীচে দেখুন)। pCUC2::gai-1-VENUS উদ্ভিদের SAM বা IPR জুড়ে কোষ বিভাজন কোণের বন্টন বন্য ধরণের উদ্ভিদের থেকে উল্লেখযোগ্যভাবে আলাদা ছিল না, যদিও অপ্রত্যাশিতভাবে আমরা দেখতে পেয়েছি যে এই উদ্ভিদগুলিতে IPR ছাড়া কোষগুলি 80-90° এর উচ্চ ফ্রিকোয়েন্সিতে বিভক্ত (চিত্র 6f-j)।
কোষ বিভাজনের দিকনির্দেশনা SAM-এর জ্যামিতির উপর নির্ভর করে, বিশেষ করে টিস্যু বক্রতা দ্বারা সৃষ্ট প্রসার্য চাপের উপর। তাই আমরা জিজ্ঞাসা করেছি যে della global mutant এবং pCUC2::gai-1-VENUS উদ্ভিদে SAM-এর আকৃতি পরিবর্তিত হয়েছে কিনা। পূর্বে রিপোর্ট করা হয়েছে 12, della global mutant SAM-এর আকার বন্য ধরণের চেয়ে বড় ছিল (পরিপূরক চিত্র 13a, b, d)। CLV3 এবং STM RNA-এর ইন সিটু হাইব্রিডাইজেশন della mutants-এ meristem সম্প্রসারণ নিশ্চিত করেছে এবং স্টেম সেল নিশের পার্শ্বীয় সম্প্রসারণ আরও দেখিয়েছে (পরিপূরক চিত্র 13e, f, h, i)। তবে, উভয় জিনোটাইপে SAM বক্রতা একই রকম ছিল (পরিপূরক চিত্র 13k, m, n, p)। আমরা gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple mutant-এর আকারে একই রকম বৃদ্ধি লক্ষ্য করেছি, বন্য ধরণের তুলনায় বক্রতার কোনও পরিবর্তন ছাড়াই (পরিপূরক চিত্র 13c, d, g, j, l, o, p)। della quadruple mutant-এর ক্ষেত্রেও কোষ বিভাজনের ফ্রিকোয়েন্সি প্রভাবিত হয়েছিল, তবে della monolithic mutant-এর তুলনায় কম পরিমাণে (পরিপূরক চিত্র 12d–f)। এই ডোজ প্রভাব, বক্রতার উপর প্রভাবের অভাবের সাথে, ইঙ্গিত দেয় যে Della quadruple mutant-এর অবশিষ্ট RGL3 কার্যকলাপ DELLA কার্যকলাপের ক্ষতির কারণে কোষ বিভাজনের ওরিয়েন্টেশনের পরিবর্তনকে সীমিত করে এবং পার্শ্বীয় কোষ বিভাজনের পরিবর্তন SAM জ্যামিতির পরিবর্তনের পরিবর্তে GA সংকেত কার্যকলাপের পরিবর্তনের প্রতিক্রিয়ায় ঘটে। উপরে বর্ণিত হিসাবে, CUC2 প্রোমোটার P4 থেকে শুরু করে SAM-তে IPR এক্সপ্রেশন চালায় (পরিপূরক চিত্র 14a, b), এবং বিপরীতে, pCUC2::gai-1-VENUS SAM-এর আকার হ্রাস পেয়েছে কিন্তু বক্রতা বেশি (পরিপূরক চিত্র 14c–h)। pCUC2::gai-1-VENUS SAM-এর এই পরিবর্তনের ফলে বন্য ধরণের তুলনায় যান্ত্রিক চাপের একটি ভিন্ন বন্টন হতে পারে, যেখানে উচ্চ পরিধিগত চাপ SAM কেন্দ্র থেকে কম দূরত্বে শুরু হয়47। বিকল্পভাবে, pCUC2::gai-1-VENUS SAM-এর আকারবিদ্যার পরিবর্তনগুলি ট্রান্সজিন এক্সপ্রেশন দ্বারা প্ররোচিত আঞ্চলিক যান্ত্রিক বৈশিষ্ট্যের পরিবর্তনের ফলে হতে পারে48। উভয় ক্ষেত্রেই, এটি GA সিগন্যালিং-এ পরিবর্তনের প্রভাবগুলিকে আংশিকভাবে অফসেট করতে পারে, যা আমাদের পর্যবেক্ষণগুলি ব্যাখ্যা করে পরিধিগত/ট্রান্সভার্স ওরিয়েন্টেশনে কোষগুলি বিভক্ত হওয়ার সম্ভাবনা বাড়িয়ে দেয়।
একসাথে নেওয়া হলে, আমাদের তথ্য নিশ্চিত করে যে উচ্চতর GA সংকেত IPR-তে কোষ বিভাজন সমতলের পার্শ্বীয় অভিযোজনে সক্রিয় ভূমিকা পালন করে। তারা আরও দেখায় যে মেরিস্টেম বক্রতা IPR-তে কোষ বিভাজন সমতলের অভিযোজনকেও প্রভাবিত করে।
উচ্চ GA সিগন্যালিং কার্যকলাপের কারণে IPR-তে বিভাজন সমতলের ট্রান্সভার্স ওরিয়েন্টেশন থেকে বোঝা যায় যে GA SAM-এর মধ্যে এপিডার্মিসে একটি রেডিয়াল সেল ফাইলকে প্রাক-সংগঠিত করে, যা পরবর্তীতে এপিডার্মাল ইন্টারনোডে পাওয়া যাবে এমন সেলুলার সংগঠনকে সংজ্ঞায়িত করে। প্রকৃতপক্ষে, ডেলা গ্লোবাল মিউট্যান্টের SAM ছবিতে এই ধরনের সেল ফাইলগুলি প্রায়শই দৃশ্যমান ছিল (চিত্র 6b)। সুতরাং, SAM-তে GA সিগন্যালিং-এর স্থানিক প্যাটার্নের বিকাশমূলক কার্যকারিতা আরও অন্বেষণ করার জন্য, আমরা ওয়াইল্ড-টাইপ (Ler এবং Col-0), ডেলা গ্লোবাল মিউট্যান্ট এবং pCUC2::gai-1-VENUS ট্রান্সজেনিক উদ্ভিদে IPR-তে কোষের স্থানিক সংগঠন বিশ্লেষণ করার জন্য টাইম-ল্যাপস ইমেজিং ব্যবহার করেছি।
আমরা দেখতে পেলাম যে qmRGA দেখিয়েছে যে IPR-তে GA সংকেত কার্যকলাপ P1/P2 থেকে বৃদ্ধি পেয়ে P4-তে পৌঁছেছে, এবং এই প্যাটার্নটি সময়ের সাথে সাথে স্থির ছিল (চিত্র 4a–f এবং পরিপূরক চিত্র 8c–f, k)। ক্রমবর্ধমান GA সংকেত সহ IPR-তে কোষগুলির স্থানিক সংগঠন বিশ্লেষণ করার জন্য, আমরা প্রথম পর্যবেক্ষণের 34 ঘন্টা পরে, অর্থাৎ দুইটিরও বেশি প্লাস্টিড বার বিশ্লেষণ করে তাদের বিকাশগত ভাগ্য অনুসারে P4-এর উপরে এবং পাশে Ler IPR কোষগুলিকে লেবেল করেছি, যা আমাদের P1/P2 থেকে P4 পর্যন্ত প্রাইমর্ডিয়াম বিকাশের সময় IPR কোষগুলি অনুসরণ করার অনুমতি দেয়। আমরা তিনটি ভিন্ন রঙ ব্যবহার করেছি: P4-এর কাছাকাছি প্রাইমর্ডিয়ামে সংহত কোষগুলির জন্য হলুদ, IPR-তে থাকা কোষগুলির জন্য সবুজ এবং উভয় প্রক্রিয়ায় অংশগ্রহণকারীদের জন্য বেগুনি (চিত্র 7a–c)। t0 (0 h) এ, P4-এর সামনে IPR কোষের 1-2 স্তর দৃশ্যমান ছিল (চিত্র 7a)। যেমনটি প্রত্যাশা করা হয়েছিল, যখন এই কোষগুলি বিভক্ত হয়েছিল, তখন তারা মূলত ট্রান্সভার্স ডিভিশন প্লেনের মাধ্যমে তা করেছিল (চিত্র 7a–c)। Col-0 SAM ব্যবহার করে একই রকম ফলাফল পাওয়া গেছে (P3-এর উপর দৃষ্টি নিবদ্ধ করে, যার সীমানা Ler-এ P4-এর মতো ভাঁজ করে), যদিও এই জিনোটাইপে ফুলের সীমানায় গঠিত ভাঁজটি IPR কোষগুলিকে আরও দ্রুত লুকিয়ে রাখে (চিত্র 7g–i)। সুতরাং, IPR কোষের বিভাজন প্যাটার্ন কোষগুলিকে রেডিয়াল সারিতে পূর্বে সংগঠিত করে, যেমন ইন্টারনোডগুলিতে। রেডিয়াল সারির সংগঠন এবং ধারাবাহিক অঙ্গগুলির মধ্যে IPR কোষের স্থানীয়করণ নির্দেশ করে যে এই কোষগুলি ইন্টারনোডাল প্রোজেনিটার।
এখানে, আমরা একটি রেটিওমেট্রিক GA সিগন্যালিং বায়োসেন্সর, qmRGA তৈরি করেছি, যা GA এবং GA রিসেপ্টর ঘনত্বের ফলে GA সিগন্যালিং কার্যকলাপের পরিমাণগত ম্যাপিং করার অনুমতি দেয় এবং এন্ডোজেনাস সিগন্যালিং পথের সাথে হস্তক্ষেপ কমিয়ে দেয়, যার ফলে কোষীয় স্তরে GA ফাংশন সম্পর্কে তথ্য সরবরাহ করে। এই লক্ষ্যে, আমরা একটি পরিবর্তিত DELLA প্রোটিন, mRGA তৈরি করেছি, যা DELLA মিথস্ক্রিয়া অংশীদারদের আবদ্ধ করার ক্ষমতা হারিয়ে ফেলেছে কিন্তু GA-প্ররোচিত প্রোটিওলাইসিসের প্রতি সংবেদনশীল রয়ে গেছে। qmRGA GA স্তরে বহির্মুখী এবং অন্তঃসত্ত্বা উভয় পরিবর্তনের প্রতি সাড়া দেয় এবং এর গতিশীল সংবেদন বৈশিষ্ট্যগুলি বিকাশের সময় GA সিগন্যালিং কার্যকলাপে স্থানিক পরিবর্তনের মূল্যায়ন সক্ষম করে। qmRGA একটি খুব নমনীয় হাতিয়ার কারণ এটির প্রকাশের জন্য ব্যবহৃত প্রোমোটার (যদি প্রয়োজন হয়) পরিবর্তন করে বিভিন্ন টিস্যুতে অভিযোজিত করা যেতে পারে, এবং GA সিগন্যালিং পথের সংরক্ষিত প্রকৃতি এবং অ্যাঞ্জিওস্পার্ম জুড়ে PFYRE মোটিফ দেওয়া হলে, এটি অন্যান্য প্রজাতির কাছে স্থানান্তরযোগ্য হওয়ার সম্ভাবনা রয়েছে। এর সাথে সামঞ্জস্য রেখে, ধানের SLR1 DELLA প্রোটিন (HYY497AAA) তে একটি সমতুল্য মিউটেশন SLR1 এর বৃদ্ধি দমনকারী কার্যকলাপকে দমন করতে দেখা গেছে, একই সাথে mRGA23 এর মতো এর GA-মধ্যস্থতা অবক্ষয়কে সামান্য হ্রাস করেছে। উল্লেখযোগ্যভাবে, Arabidopsis-এর সাম্প্রতিক গবেষণায় দেখা গেছে যে PFYRE ডোমেন (S474L) -এ একটি একক অ্যামিনো অ্যাসিড মিউটেশন RGA এর ট্রান্সক্রিপশনাল কার্যকলাপকে পরিবর্তন করেছে, ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর অংশীদারদের সাথে মিথস্ক্রিয়া করার ক্ষমতাকে প্রভাবিত না করেই। যদিও এই মিউটেশন mRGA-তে উপস্থিত 3টি অ্যামিনো অ্যাসিড প্রতিস্থাপনের খুব কাছাকাছি, আমাদের গবেষণায় দেখা গেছে যে এই দুটি মিউটেশন DELLA-এর স্বতন্ত্র বৈশিষ্ট্যগুলিকে পরিবর্তন করে। যদিও বেশিরভাগ ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর অংশীদার DELLA26,51 এর LHR1 এবং SAW ডোমেনের সাথে আবদ্ধ হয়, PFYRE ডোমেনের কিছু সংরক্ষিত অ্যামিনো অ্যাসিড এই মিথস্ক্রিয়াগুলিকে স্থিতিশীল করতে সাহায্য করতে পারে।
উদ্ভিদ স্থাপত্য এবং ফলন উন্নতির ক্ষেত্রে ইন্টারনোড বিকাশ একটি গুরুত্বপূর্ণ বৈশিষ্ট্য। qmRGA IPR ইন্টারনোড প্রোজেনিটর কোষে উচ্চতর GA সংকেত কার্যকলাপ প্রকাশ করেছে। পরিমাণগত ইমেজিং এবং জেনেটিক্স একত্রিত করে, আমরা দেখিয়েছি যে GA সংকেত প্যাটার্নগুলি SAM এপিডার্মিসে বৃত্তাকার/ট্রান্সভার্স কোষ বিভাজন সমতলগুলিকে সুপারইম্পোজ করে, ইন্টারনোড বিকাশের জন্য প্রয়োজনীয় কোষ বিভাজন সংগঠনকে গঠন করে। বিকাশের সময় কোষ বিভাজন সমতল অভিযোজনের বেশ কয়েকটি নিয়ন্ত্রক সনাক্ত করা হয়েছে52,53। আমাদের কাজটি GA সংকেত কার্যকলাপ কীভাবে এই কোষীয় পরামিতি নিয়ন্ত্রণ করে তার একটি স্পষ্ট উদাহরণ প্রদান করে। DELLA প্রিফোল্ডিং প্রোটিন কমপ্লেক্সের সাথে ইন্টারঅ্যাক্ট করতে পারে41, তাই GA সংকেত কর্টিকাল মাইক্রোটিউবুল ওরিয়েন্টেশনকে সরাসরি প্রভাবিত করে কোষ বিভাজন সমতল ওরিয়েন্টেশন নিয়ন্ত্রণ করতে পারে40,41,54,55। আমরা অপ্রত্যাশিতভাবে দেখিয়েছি যে SAM-তে, উচ্চতর GA সংকেত কার্যকলাপের সম্পর্ক কোষের প্রসারণ বা বিভাজন ছিল না, বরং শুধুমাত্র বৃদ্ধি অ্যানিসোট্রপি ছিল, যা IPR-তে কোষ বিভাজনের দিকের উপর GA-এর সরাসরি প্রভাবের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ। তবে, আমরা বাদ দিতে পারি না যে এই প্রভাবটি পরোক্ষও হতে পারে, উদাহরণস্বরূপ GA-প্ররোচিত কোষ প্রাচীর নরমকরণ দ্বারা মধ্যস্থতা করা56। কোষ প্রাচীরের বৈশিষ্ট্যের পরিবর্তন যান্ত্রিক চাপ সৃষ্টি করে57,58, যা কর্টিকাল মাইক্রোটিউবুলের ওরিয়েন্টেশনকে প্রভাবিত করে কোষ বিভাজন সমতলের ওরিয়েন্টেশনকেও প্রভাবিত করতে পারে39,46,59। GA-প্ররোচিত যান্ত্রিক চাপ এবং GA দ্বারা মাইক্রোটিউবুল ওরিয়েন্টেশনের সরাসরি নিয়ন্ত্রণের সম্মিলিত প্রভাব ইন্টারনোডগুলি সংজ্ঞায়িত করার জন্য IPR-তে কোষ বিভাজন ওরিয়েন্টেশনের একটি নির্দিষ্ট প্যাটার্ন তৈরিতে জড়িত থাকতে পারে এবং এই ধারণাটি পরীক্ষা করার জন্য আরও গবেষণা প্রয়োজন। একইভাবে, পূর্ববর্তী গবেষণায় ইন্টারনোড গঠন নিয়ন্ত্রণে DELLA-ইন্টারঅ্যাক্টিং প্রোটিন TCP14 এবং 15 এর গুরুত্ব তুলে ধরা হয়েছে60,61 এবং এই কারণগুলি BREVIPEDICELLUS (BP) এবং PENNYWISE (PNY) এর সাথে GA এর ক্রিয়াকে মধ্যস্থতা করতে পারে, যা ইন্টারনোড বিকাশ নিয়ন্ত্রণ করে এবং GA সংকেতকে প্রভাবিত করে দেখানো হয়েছে2,62। যেহেতু DELLA গুলি ব্রাসিনোস্টেরয়েড, ইথিলিন, জেসমনিক অ্যাসিড এবং অ্যাবসিসিক অ্যাসিড (ABA) সিগন্যালিং পথের সাথে মিথস্ক্রিয়া করে এবং এই হরমোনগুলি মাইক্রোটিউবুল ওরিয়েন্টেশনকে প্রভাবিত করতে পারে, তাই কোষ বিভাজনের ওরিয়েন্টেশনের উপর GA এর প্রভাব অন্যান্য হরমোন দ্বারাও মধ্যস্থতা করা যেতে পারে।
প্রাথমিক সাইটোলজিক্যাল গবেষণায় দেখা গেছে যে ইন্টারনোড বিকাশের জন্য অ্যারাবিডোপসিস SAM-এর অভ্যন্তরীণ এবং বহিঃস্থ উভয় অঞ্চলই প্রয়োজন। GA সক্রিয়ভাবে অভ্যন্তরীণ টিস্যুতে কোষ বিভাজন নিয়ন্ত্রণ করে12, SAM-তে মেরিস্টেম এবং ইন্টারনোড আকার নিয়ন্ত্রণে GA-এর দ্বৈত কার্যকারিতা সমর্থন করে। অভ্যন্তরীণ SAM টিস্যুতেও দিকনির্দেশক কোষ বিভাজনের ধরণটি কঠোরভাবে নিয়ন্ত্রিত হয় এবং এই নিয়ন্ত্রণ কান্ডের বৃদ্ধির জন্য অপরিহার্য52। অভ্যন্তরীণ SAM সংগঠনে কোষ বিভাজন সমতলকে অভিমুখী করার ক্ষেত্রে GA-এর ভূমিকা কী, তা পরীক্ষা করা আকর্ষণীয় হবে, যার ফলে SAM-এর মধ্যে ইন্টারনোডের স্পেসিফিকেশন এবং বিকাশ সিঙ্ক্রোনাইজ হয় কিনা।
মাটিতে ইন ভিট্রো অথবা ১x মুরাশিগে-স্কুগ (এমএস) মাধ্যমে (ডুচেফা) ১% সুক্রোজ এবং ১% আগর (সিগমা) দিয়ে পরিপূরক হিসেবে আদর্শ অবস্থায় (১৬ ঘন্টা আলো, ২২ ডিগ্রি সেলসিয়াস) গাছপালা জন্মানো হয়েছিল, হাইপোকোটাইল এবং মূল বৃদ্ধির পরীক্ষাগুলি ছাড়া যেখানে স্থির আলো এবং ২২ ডিগ্রি সেলসিয়াসে উল্লম্ব প্লেটে চারা জন্মানো হয়েছিল। নাইট্রেট পরীক্ষার জন্য, দীর্ঘ দিনের পরিস্থিতিতে পর্যাপ্ত নাইট্রেট (০ বা ১০ মিমি KNO3), ০.৫ মিমি NH4-সাক্সিনেট, ১% সুক্রোজ এবং ১% এ-আগার (সিগমা) দিয়ে পরিপূরক হিসেবে পরিবর্তিত MS মাধ্যমে (বায়োওয়ার্ল্ড উদ্ভিদ মাধ্যমে) গাছপালা জন্মানো হয়েছিল।
pDONR221-এ ঢোকানো GID1a cDNA pDONR P4-P1R-pUBQ10 এবং pDONR P2R-P3-mCherry-এর সাথে pB7m34GW-এ পুনঃসংযুক্ত করা হয়েছিল যাতে pUBQ10::GID1a-mCherry উৎপন্ন হয়। pDONR221-এ ঢোকানো IDD2 DNA pB7RWG266-এর সাথে পুনঃসংযুক্ত করা হয়েছিল যাতে p35S:IDD2-RFP উৎপন্ন হয়। pGID1b::2xmTQ2-GID1b তৈরি করার জন্য, GID1b কোডিং অঞ্চলের উপরের দিকে একটি 3.9 kb টুকরো এবং GID1b cDNA (1.3 kb) এবং টার্মিনেটর (3.4 kb) ধারণকারী একটি 4.7 kb টুকরো প্রথমে পরিপূরক সারণি 3-এর প্রাইমার ব্যবহার করে প্রশস্ত করা হয়েছিল এবং তারপর যথাক্রমে pDONR P4-P1R (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) এবং pDONR P2R-P3 (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) এ সন্নিবেশ করা হয়েছিল, এবং অবশেষে গেটওয়ে ক্লোনিং ব্যবহার করে pGreen 012567 টার্গেট ভেক্টরে pDONR221 2xmTQ268 এর সাথে পুনরায় সংযুক্ত করা হয়েছিল। pCUC2::LSSmOrange উৎপন্ন করার জন্য, CUC2 প্রোমোটার সিকোয়েন্স (ATG এর 3229 bp আপস্ট্রিম) এবং তারপরে N7 নিউক্লিয়ার লোকালাইজেশন সিগন্যাল সহ বৃহৎ স্টোকস-শিফটেড mOrange (LSSmOrange)69 এর কোডিং সিকোয়েন্স এবং NOS ট্রান্সক্রিপশনাল টার্মিনেটরকে গেটওয়ে 3-ফ্র্যাগমেন্ট রিকম্বিনেশন সিস্টেম (ইনভিট্রোজেন) ব্যবহার করে pGreen kanamycin টার্গেটিং ভেক্টরে একত্রিত করা হয়েছিল। উদ্ভিদ বাইনারি ভেক্টরটি Agrobacterium tumefaciens স্ট্রেন GV3101-এ প্রবর্তিত হয়েছিল এবং Agrobacterium অনুপ্রবেশ পদ্ধতি দ্বারা Nicotiana benthamiana পাতায় এবং Floral dip পদ্ধতি দ্বারা Arabidopsis thaliana Col-0-এ প্রবর্তিত হয়েছিল। pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry এবং pCLV3::mCherry-NLS qmRGA যথাক্রমে সংশ্লিষ্ট ক্রসের F3 এবং F1 বংশধর থেকে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল।
RNA ইন সিটু হাইব্রিডাইজেশন প্রায় 1 সেমি লম্বা অঙ্কুর টিপস72-তে করা হয়েছিল, যেগুলি সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং তাৎক্ষণিকভাবে FAA দ্রবণে (3.7% ফর্মালডিহাইড, 5% অ্যাসিটিক অ্যাসিড, 50% ইথানল) স্থির করা হয়েছিল যা 4 °C তাপমাত্রায় প্রাক-ঠান্ডা করা হয়েছিল। 2 × 15 মিনিট ভ্যাকুয়াম চিকিত্সার পরে, ফিক্সেটিভ পরিবর্তন করা হয়েছিল এবং নমুনাগুলি রাতারাতি ইনকিউবেট করা হয়েছিল। GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, এবং RGL3 cDNA এবং তাদের 3′-UTR-এর অ্যান্টিসেন্স প্রোবগুলি রোজিয়ার এট আল.73 দ্বারা বর্ণিত পরিপূরক সারণি 3-এ দেখানো প্রাইমার ব্যবহার করে সংশ্লেষিত করা হয়েছিল। ডিগক্সিজেনিন-লেবেলযুক্ত প্রোবগুলি ডিগক্সিজেনিন অ্যান্টিবডি (3000-ভাঁজ তরলীকরণ; রোশে, ক্যাটালগ নম্বর: 11 093 274 910) ব্যবহার করে ইমিউনোডিটেক্ট করা হয়েছিল, এবং অংশগুলিকে 5-ব্রোমো-4-ক্লোরো-3-ইন্ডোলাইল ফসফেট (BCIP, 250-ভাঁজ তরলীকরণ)/নাইট্রোব্লু টেট্রাজোলিয়াম (NBT, 200-ভাঁজ তরলীকরণ) দ্রবণ দিয়ে দাগ দেওয়া হয়েছিল।