পরিমাণগত জিবেরেলিন বায়োসেন্সর শুট এপিকাল মেরিস্টেমে ইন্টারনোড নির্দিষ্টকরণে জিবেরেলিনের ভূমিকা উন্মোচন করে

কাণ্ডের গঠনবিন্যাসের জন্য শুট এপিকাল মেরিস্টেম (SAM)-এর বৃদ্ধি অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ। উদ্ভিদ হরমোনগিবেরেলিনজিএ (GA) উদ্ভিদের বৃদ্ধি সমন্বয়ে গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে, কিন্তু এসএএম (SAM)-এ এর ভূমিকা এখনও ভালোভাবে বোঝা যায়নি। এখানে, আমরা ডেলা (DELLA) প্রোটিনকে এমনভাবে ইঞ্জিনিয়ারিং করে জিএ সিগন্যালিং-এর একটি রেশিওমেট্রিক বায়োসেন্সর তৈরি করেছি, যাতে জিএ ট্রান্সক্রিপশনাল প্রতিক্রিয়ায় এর অপরিহার্য নিয়ন্ত্রক কাজটি দমন করা যায়, কিন্তু জিএ শনাক্তকরণের পর এর অবক্ষয় প্রক্রিয়াটি অক্ষুণ্ণ থাকে। আমরা দেখিয়েছি যে এই অবক্ষয়-ভিত্তিক বায়োসেন্সরটি বিকাশের সময় জিএ-এর মাত্রা এবং কোষীয় সংবেদনের পরিবর্তনগুলি নির্ভুলভাবে রেকর্ড করে। আমরা এই বায়োসেন্সরটি ব্যবহার করে এসএএম-এ জিএ সিগন্যালিং কার্যকলাপের মানচিত্র তৈরি করেছি। আমরা দেখিয়েছি যে উচ্চ জিএ সংকেত প্রধানত অঙ্গ প্রাইমর্ডিয়ার মধ্যবর্তী কোষগুলিতে উপস্থিত থাকে, যা ইন্টারনোড কোষের পূর্বসূরী। গেইন-অফ-ফাংশন এবং লস-অফ-ফাংশন পদ্ধতি ব্যবহার করে, আমরা আরও দেখিয়েছি যে জিএ কোষ বিভাজন তলের অভিমুখ নিয়ন্ত্রণ করে, ইন্টারনোডের আদর্শ কোষীয় বিন্যাস প্রতিষ্ঠা করে এবং এর মাধ্যমে এসএএম-এ ইন্টারনোড নির্দিষ্টকরণকে উৎসাহিত করে।
কাণ্ডের শীর্ষে অবস্থিত শুট এপিকাল মেরিস্টেম (SAM)-এ স্টেম কোষের একটি বিশেষ পরিবেশ থাকে, যার ক্রিয়াকলাপ উদ্ভিদের জীবনকাল জুড়ে একটি মডিউলার এবং পুনরাবৃত্তিমূলক পদ্ধতিতে পার্শ্বীয় অঙ্গ এবং কাণ্ডের পর্ব তৈরি করে। এই পুনরাবৃত্তিমূলক একক বা উদ্ভিদ পর্বগুলোর প্রতিটিতে পর্বমধ্য এবং পার্শ্বীয় অঙ্গ থাকে, এবং পাতার কক্ষে কাক্ষিক মেরিস্টেম থাকে¹। বিকাশের সময় উদ্ভিদ পর্বের বৃদ্ধি এবং গঠন পরিবর্তিত হয়। অ্যারাবিডোপসিসে, অঙ্গজ পর্যায়ে পর্বমধ্যের বৃদ্ধি দমন করা হয় এবং রোজেট পাতার কক্ষে কাক্ষিক মেরিস্টেম সুপ্ত থাকে। পুষ্প পর্যায়ে রূপান্তরের সময়, SAM পুষ্পমঞ্জরি মেরিস্টেমে পরিণত হয়, যা দীর্ঘায়িত পর্বমধ্য এবং কাক্ষিক মুকুল, কাণ্ডীয় পাতার কক্ষে শাখা-প্রশাখা এবং পরে, পত্রহীন ফুল তৈরি করে²। যদিও আমরা পাতা, ফুল এবং শাখার সূচনা নিয়ন্ত্রণকারী প্রক্রিয়াগুলো বোঝার ক্ষেত্রে উল্লেখযোগ্য অগ্রগতি করেছি, পর্বমধ্য কীভাবে উৎপন্ন হয় সে সম্পর্কে তুলনামূলকভাবে কম জানা গেছে।
GA-এর স্থানকালিক বন্টন বোঝা বিভিন্ন কলায় এবং বিভিন্ন বিকাশের পর্যায়ে এই হরমোনগুলির কার্যকারিতা আরও ভালোভাবে বুঝতে সাহায্য করবে। নিজস্ব প্রোমোটারের ক্রিয়ায় প্রকাশিত RGA-GFP ফিউশনের অবক্ষয় পর্যবেক্ষণ মূলে মোট GA-এর মাত্রা নিয়ন্ত্রণের বিষয়ে গুরুত্বপূর্ণ তথ্য প্রদান করে¹⁵,¹⁶। তবে, RGA-এর প্রকাশ বিভিন্ন কলায় ভিন্ন হয়¹⁷ এবং এটি GA দ্বারা নিয়ন্ত্রিত হয়¹⁸। সুতরাং, RGA প্রোমোটারের ডিফারেনশিয়াল এক্সপ্রেশনের ফলে RGA-GFP-এর সাথে পর্যবেক্ষণ করা ফ্লুরোসেন্স প্যাটার্ন দেখা যেতে পারে এবং তাই এই পদ্ধতিটি পরিমাণগত নয়। অতি সম্প্রতি, বায়োঅ্যাকটিভ ফ্লুরেসিন (Fl)-লেবেলযুক্ত GA¹⁹,²⁰ মূলের এন্ডোকর্টেক্সে GA-এর সঞ্চয় এবং GA পরিবহনের মাধ্যমে এর কোষীয় মাত্রার নিয়ন্ত্রণ প্রকাশ করেছে। সম্প্রতি, GA FRET সেন্সর nlsGPS¹ দেখিয়েছে যে GA-এর মাত্রা মূল, ফিলামেন্ট এবং অন্ধকারে বর্ধিত হাইপোকোটাইলে কোষের প্রসারণের সাথে সম্পর্কিত²¹। তবে, যেমন আমরা দেখেছি, GA-এর ঘনত্বই GA সিগন্যালিং কার্যকলাপ নিয়ন্ত্রণের একমাত্র প্যারামিটার নয়, কারণ এটি জটিল সেন্সিং প্রক্রিয়ার উপর নির্ভর করে। এখানে, DELLA এবং GA সিগন্যালিং পাথওয়ে সম্পর্কে আমাদের উপলব্ধির উপর ভিত্তি করে, আমরা GA সিগন্যালিং-এর জন্য একটি অবক্ষয়-ভিত্তিক রেশিওমেট্রিক বায়োসেন্সরের বিকাশ এবং বৈশিষ্ট্য নিরূপণের প্রতিবেদন দিচ্ছি। এই পরিমাণগত বায়োসেন্সরটি তৈরি করার জন্য, আমরা একটি মিউট্যান্ট GA-সংবেদনশীল RGA ব্যবহার করেছি যা একটি ফ্লুরোসেন্ট প্রোটিনের সাথে ফিউজ করা হয়েছিল এবং টিস্যুতে সর্বব্যাপীভাবে প্রকাশিত হয়েছিল, পাশাপাশি একটি GA-অসংবেদনশীল ফ্লুরোসেন্ট প্রোটিনও ব্যবহার করেছি। আমরা দেখিয়েছি যে মিউট্যান্ট RGA প্রোটিন ফিউশনগুলি সর্বব্যাপী প্রকাশিত হলে এন্ডোজেনাস GA সিগন্যালিং-এ হস্তক্ষেপ করে না, এবং এই বায়োসেন্সরটি উচ্চ স্থানকালিক রেজোলিউশনে GA ইনপুট এবং সেন্সিং অ্যাপারেটাস দ্বারা GA সিগন্যাল প্রক্রিয়াকরণ উভয় থেকেই সৃষ্ট সিগন্যালিং কার্যকলাপের পরিমাণ নির্ধারণ করতে পারে। আমরা এই বায়োসেন্সরটি ব্যবহার করে GA সিগন্যালিং কার্যকলাপের স্থানকালিক বন্টন ম্যাপ করেছি এবং SAM এপিডার্মিসে GA কীভাবে কোষীয় আচরণ নিয়ন্ত্রণ করে তার পরিমাণ নির্ধারণ করেছি। আমরা প্রমাণ করেছি যে GA অর্গান প্রাইমর্ডিয়ার মধ্যে অবস্থিত SAM কোষগুলির বিভাজন তলের অভিমুখ নিয়ন্ত্রণ করে, যার ফলে ইন্টারনোডের ক্যানোনিকাল কোষীয় সংগঠন নির্ধারিত হয়।
অবশেষে, আমরা জানতে চেয়েছিলাম যে qmRGA ক্রমবর্ধমান হাইপোকোটাইল ব্যবহার করে অন্তঃস্থ GA স্তরের পরিবর্তন সম্পর্কে তথ্য দিতে পারে কিনা। আমরা পূর্বে দেখিয়েছি যে নাইট্রেট GA সংশ্লেষণ বৃদ্ধি করে এবং ফলস্বরূপ DELLA34-এর অবক্ষয় ঘটিয়ে বৃদ্ধিকে উদ্দীপিত করে। সেই অনুযায়ী, আমরা লক্ষ্য করেছি যে প্রচুর নাইট্রেট সরবরাহের (10 mM NO3−) অধীনে বেড়ে ওঠা pUBQ10::qmRGA চারাগাছের হাইপোকোটাইলের দৈর্ঘ্য, নাইট্রেট-ঘাটতি পরিস্থিতিতে বেড়ে ওঠা চারাগাছের তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি ছিল (পরিপূরক চিত্র 6a)। এই বৃদ্ধি প্রতিক্রিয়ার সাথে সামঞ্জস্য রেখে, নাইট্রেটের অনুপস্থিতিতে বেড়ে ওঠা চারাগাছের তুলনায় 10 mM NO3− পরিস্থিতিতে বেড়ে ওঠা চারাগাছের হাইপোকোটাইলে GA সংকেত বেশি ছিল (পরিপূরক চিত্র 6b, c)। সুতরাং, qmRGA অন্তঃস্থ GA ঘনত্বের পরিবর্তনের দ্বারা প্ররোচিত GA সংকেতের পরিবর্তন পর্যবেক্ষণ করতেও সক্ষম।
সেন্সরের নকশা অনুযায়ী প্রত্যাশিতভাবে, qmRGA দ্বারা শনাক্তকৃত GA সংকেত প্রদানের কার্যকলাপ GA-এর ঘনত্ব এবং GA উপলব্ধির উপর নির্ভরশীল কিনা তা বোঝার জন্য, আমরা উদ্ভিদের অঙ্গজ এবং প্রজনন কলায় তিনটি GID1 রিসেপ্টরের অভিব্যক্তি বিশ্লেষণ করেছি। চারাগাছে, GID1-GUS রিপোর্টার লাইনটি দেখিয়েছে যে GID1a এবং c বীজপত্রে উচ্চ মাত্রায় প্রকাশিত হয় (চিত্র ৩ক-গ)। এছাড়াও, তিনটি রিসেপ্টরই পাতা, পার্শ্বমূলের গোড়া, মূলের অগ্রভাগ (GID1b-এর মূল টুপি ছাড়া) এবং সংবহনতন্ত্রে প্রকাশিত হয় (চিত্র ৩ক-গ)। পুষ্পমঞ্জরির SAM-এ, আমরা শুধুমাত্র GID1b এবং 1c-এর জন্য GUS সংকেত শনাক্ত করেছি (পরিপূরক চিত্র ৭ক-গ)। ইন সিটু হাইব্রিডাইজেশন এই অভিব্যক্তির ধরণগুলো নিশ্চিত করেছে এবং আরও দেখিয়েছে যে GID1c SAM-এ কম মাত্রায় সুষমভাবে প্রকাশিত হয়, যেখানে GID1b SAM-এর পরিধিতে উচ্চ মাত্রায় প্রকাশিত হয় (পরিপূরক চিত্র ৭ঘ-ল)। pGID1b::2xmTQ2-GID1b ট্রান্সলেশনাল ফিউশনটি GID1b এক্সপ্রেশনের একটি ক্রমিক পরিসরও প্রকাশ করেছে, যা SAM-এর কেন্দ্রে কম বা কোনো এক্সপ্রেশন না থাকা থেকে শুরু করে অঙ্গের সীমানায় উচ্চ এক্সপ্রেশন পর্যন্ত বিস্তৃত (পরিপূরক চিত্র 7m)। সুতরাং, GID1 রিসেপ্টরগুলো টিস্যুর সর্বত্র এবং অভ্যন্তরে সমানভাবে বণ্টিত নয়। পরবর্তী পরীক্ষাগুলোতে, আমরা আরও পর্যবেক্ষণ করেছি যে GID1-এর ওভারএক্সপ্রেশন (pUBQ10::GID1a-mCherry) হাইপোকোটাইলে বাহ্যিক GA প্রয়োগের প্রতি qmRGA-এর সংবেদনশীলতা বৃদ্ধি করেছে (চিত্র 3d, e)। এর বিপরীতে, হাইপোকোটাইলে qd17mRGA দ্বারা পরিমাপকৃত ফ্লুরোসেন্স GA3 প্রয়োগের প্রতি অসংবেদনশীল ছিল (চিত্র 3f, g)। উভয় অ্যাসের জন্য, সেন্সরের দ্রুত আচরণ মূল্যায়ন করতে চারাগাছগুলোকে উচ্চ ঘনত্বের GA (100 μM GA3) দিয়ে ট্রিটমেন্ট করা হয়েছিল, যেখানে GID1 রিসেপ্টরের সাথে আবদ্ধ হওয়ার ক্ষমতা বৃদ্ধি বা হ্রাস পেয়েছিল। সম্মিলিতভাবে, এই ফলাফলগুলি নিশ্চিত করে যে qmRGA বায়োসেন্সরটি একটি GA এবং GA সেন্সর হিসাবে সম্মিলিত কার্য সম্পাদন করে, এবং ইঙ্গিত দেয় যে GID1 রিসেপ্টরের ডিফারেনশিয়াল এক্সপ্রেশন সেন্সরটির নিঃসরণ ক্ষমতাকে উল্লেখযোগ্যভাবে পরিবর্তন করতে পারে।
এখন পর্যন্ত, SAM-এ GA সংকেতের বণ্টন অস্পষ্ট রয়ে গেছে। তাই, আমরা qmRGA-প্রকাশকারী উদ্ভিদ এবং pCLV3::mCherry-NLS স্টেম সেল রিপোর্টার35 ব্যবহার করে GA সংকেত কার্যকলাপের উচ্চ-রেজোলিউশন পরিমাণগত মানচিত্র গণনা করেছি, বিশেষত L1 স্তরের (এপিডার্মিস; চিত্র 4a, b, পদ্ধতি এবং পরিপূরক পদ্ধতি দেখুন) উপর মনোযোগ দিয়ে, কারণ L1 স্তর SAM বৃদ্ধি নিয়ন্ত্রণে একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে36। এখানে, pCLV3::mCherry-NLS প্রকাশ GA সংকেত কার্যকলাপের স্থানকালিক বণ্টন বিশ্লেষণের জন্য একটি স্থির জ্যামিতিক নির্দেশক বিন্দু প্রদান করেছে37। যদিও GA পার্শ্বীয় অঙ্গ বিকাশের জন্য অপরিহার্য বলে মনে করা হয়4, আমরা লক্ষ্য করেছি যে P3 পর্যায় থেকে শুরু করে ফুলের প্রাইমর্ডিয়ামে (P) GA সংকেত কম ছিল (চিত্র 4a, b), যেখানে তরুণ P1 এবং P2 প্রাইমর্ডিয়ামগুলিতে কেন্দ্রীয় অঞ্চলের মতো মাঝারি কার্যকলাপ ছিল (চিত্র 4a, b)। অঙ্গের আদিম কোষের সীমানায় উচ্চতর GA সংকেত সক্রিয়তা শনাক্ত করা হয়েছিল, যা P1/P2 (সীমানার পাশে) থেকে শুরু হয়ে P4-এ সর্বোচ্চ পর্যায়ে পৌঁছেছিল, এবং সেইসাথে আদিম কোষগুলোর মাঝখানে অবস্থিত প্রান্তীয় অঞ্চলের সমস্ত কোষেও এটি দেখা গিয়েছিল (চিত্র ৪ক, খ এবং পরিপূরক চিত্র ৮ক, খ)। এই উচ্চতর GA সংকেত সক্রিয়তা শুধুমাত্র এপিডার্মিসে নয়, বরং L2 এবং উপরের L3 স্তরেও পরিলক্ষিত হয়েছিল (পরিপূরক চিত্র ৮খ)। qmRGA ব্যবহার করে SAM-এ শনাক্তকৃত GA সংকেতের বিন্যাসও সময়ের সাথে অপরিবর্তিত ছিল (পরিপূরক চিত্র ৮গ–চ, ক)। যদিও আমরা বিস্তারিতভাবে বৈশিষ্ট্যযুক্ত পাঁচটি স্বাধীন লাইনের T3 উদ্ভিদের SAM-এ qd17mRGA কনস্ট্রাক্টটি পদ্ধতিগতভাবে নিম্ন-নিয়ন্ত্রিত ছিল, আমরা pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP কনস্ট্রাক্ট দিয়ে প্রাপ্ত ফ্লুরোসেন্স প্যাটার্ন বিশ্লেষণ করতে সক্ষম হয়েছিলাম (পরিপূরক চিত্র ৮ছ–ঞ, ল)। এই কন্ট্রোল লাইনে, SAM-এ ফ্লুরোসেন্স অনুপাতের শুধুমাত্র সামান্য পরিবর্তন শনাক্ত করা হয়েছিল, কিন্তু SAM কেন্দ্রে আমরা TagBFP-এর সাথে সম্পর্কিত VENUS-এর একটি স্পষ্ট এবং অপ্রত্যাশিত হ্রাস লক্ষ্য করেছি। এটি নিশ্চিত করে যে qmRGA দ্বারা পর্যবেক্ষণ করা সিগন্যালিং প্যাটার্নটি mRGA-VENUS-এর GA-নির্ভর অবক্ষয়কে প্রতিফলিত করে, তবে এটিও প্রমাণ করে যে qmRGA মেরিস্টেম কেন্দ্রে GA সিগন্যালিং কার্যকলাপকে অতিরিক্ত মূল্যায়ন করতে পারে। সংক্ষেপে, আমাদের ফলাফল একটি GA সিগন্যালিং প্যাটার্ন প্রকাশ করে যা প্রাথমিকভাবে প্রাইমর্ডিয়ার বন্টনকে প্রতিফলিত করে। আন্তঃ-প্রাইমর্ডিয়াল অঞ্চলের (IPR) এই বন্টনটি বিকাশমান প্রাইমর্ডিয়া এবং কেন্দ্রীয় অঞ্চলের মধ্যে উচ্চ GA সিগন্যালিং কার্যকলাপের ধীরে ধীরে প্রতিষ্ঠার কারণে ঘটে, যখন একই সময়ে প্রাইমর্ডিয়াতে GA সিগন্যালিং কার্যকলাপ হ্রাস পায় (চিত্র ৪গ, ঘ)।
GID1b এবং GID1c রিসেপ্টরগুলির বিন্যাস (উপরে দেখুন) ইঙ্গিত দেয় যে GA রিসেপ্টরগুলির ডিফারেনশিয়াল এক্সপ্রেশন SAM-এ GA সিগন্যালিং কার্যকলাপের ধরণকে আকার দিতে সাহায্য করে। আমরা ভেবেছিলাম যে GA-এর ডিফারেনশিয়াল সঞ্চয়ন এর সাথে জড়িত থাকতে পারে কিনা। এই সম্ভাবনাটি তদন্ত করার জন্য, আমরা nlsGPS1 GA FRET সেন্সর ব্যবহার করেছি। ১০০ মিনিটের জন্য ১০ μM GA4+7 দিয়ে ট্রিট করা nlsGPS1-এর SAM-এ বর্ধিত অ্যাক্টিভেশন ফ্রিকোয়েন্সি সনাক্ত করা হয়েছিল (পরিপূরক চিত্র ৯ক-ঙ), যা নির্দেশ করে যে nlsGPS1 মূলের মতো SAM-এও GA ঘনত্বের পরিবর্তনে সাড়া দেয়। nlsGPS1 অ্যাক্টিভেশন ফ্রিকোয়েন্সির স্থানিক বিন্যাস SAM-এর বাইরের স্তরগুলিতে তুলনামূলকভাবে কম GA স্তর প্রকাশ করেছে, কিন্তু দেখিয়েছে যে SAM-এর কেন্দ্রে এবং সীমানায় এটি বেশি ছিল (চিত্র ৪ঙ এবং পরিপূরক চিত্র ৯ক,গ)। এটি পরামর্শ দেয় যে GA SAM-এও qmRGA দ্বারা প্রকাশিত বিন্যাসের সাথে তুলনীয় একটি স্থানিক বিন্যাসে বিতরণ করা হয়। একটি পরিপূরক পদ্ধতি হিসেবে, আমরা SAM-কে ফ্লুরোসেন্ট GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) অথবা নেগেটিভ কন্ট্রোল হিসেবে শুধু Fl দিয়েও ট্রিট করেছি। Fl সিগন্যালটি কেন্দ্রীয় অঞ্চল এবং প্রাইমর্ডিয়াম সহ পুরো SAM জুড়েই ছড়িয়ে পড়েছিল, যদিও এর তীব্রতা কম ছিল (চিত্র 4j এবং পরিপূরক চিত্র 10d)। এর বিপরীতে, তিনটি GA-Fl-ই বিশেষভাবে প্রাইমর্ডিয়ামের সীমানার মধ্যে এবং IPR-এর বাকি অংশে বিভিন্ন মাত্রায় জমা হয়েছিল, যার মধ্যে GA7-Fl IPR-এর সবচেয়ে বড় অংশে জমা হয় (চিত্র 4k এবং পরিপূরক চিত্র 10a,b)। ফ্লুরোসেন্স তীব্রতার পরিমাণ নির্ধারণ করে দেখা গেছে যে, Fl-ট্রিটেড SAM-এর তুলনায় GA-Fl-ট্রিটেড SAM-এ IPR ও নন-IPR তীব্রতার অনুপাত বেশি ছিল (চিত্র 4l এবং পরিপূরক চিত্র 10c)। সব মিলিয়ে, এই ফলাফলগুলো থেকে বোঝা যায় যে, অঙ্গের সীমানার সবচেয়ে কাছে অবস্থিত IPR কোষগুলোতে GA উচ্চতর ঘনত্বে উপস্থিত থাকে। এটি ইঙ্গিত দেয় যে SAM GA সংকেত কার্যকলাপের ধরণটি GA রিসেপ্টরগুলির ভিন্ন ভিন্ন প্রকাশ এবং অঙ্গের সীমানার কাছাকাছি IPR কোষগুলিতে GA-এর ভিন্ন ভিন্ন সঞ্চয়—উভয়েরই ফল। সুতরাং, আমাদের বিশ্লেষণে GA সংকেতের একটি অপ্রত্যাশিত স্থানকালিক ধরণ প্রকাশিত হয়েছে, যেখানে SAM-এর কেন্দ্র এবং প্রিমর্ডিয়ামে কার্যকলাপ কম এবং প্রান্তীয় অঞ্চলের IPR-এ কার্যকলাপ বেশি।
SAM-এ ডিফারেনশিয়াল GA সিগন্যালিং অ্যাক্টিভিটির ভূমিকা বোঝার জন্য, আমরা SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS-এর রিয়েল-টাইম টাইম-ল্যাপস ইমেজিং ব্যবহার করে GA সিগন্যালিং অ্যাক্টিভিটি, কোষ প্রসারণ এবং কোষ বিভাজনের মধ্যে পারস্পরিক সম্পর্ক বিশ্লেষণ করেছি। বৃদ্ধি নিয়ন্ত্রণে GA-এর ভূমিকার পরিপ্রেক্ষিতে, কোষ প্রসারণ প্যারামিটারগুলির সাথে একটি ধনাত্মক পারস্পরিক সম্পর্ক প্রত্যাশিত ছিল। তাই, আমরা প্রথমে GA সিগন্যালিং অ্যাক্টিভিটি ম্যাপগুলিকে কোষ পৃষ্ঠের বৃদ্ধির হারের ম্যাপের সাথে (একটি নির্দিষ্ট কোষ এবং বিভাজনের সময়কার অপত্য কোষগুলির জন্য কোষ প্রসারণের শক্তির প্রক্সি হিসাবে) এবং বৃদ্ধির অ্যানাইসোট্রপির ম্যাপের সাথে তুলনা করেছি, যা কোষ প্রসারণের দিকনির্দেশনা পরিমাপ করে (এটিও এখানে একটি নির্দিষ্ট কোষ এবং বিভাজনের সময়কার অপত্য কোষগুলির জন্য ব্যবহৃত হয়েছে; চিত্র 5a,b, পদ্ধতি এবং পরিপূরক পদ্ধতি দেখুন)। আমাদের SAM কোষ পৃষ্ঠের বৃদ্ধির হারের ম্যাপগুলি পূর্ববর্তী পর্যবেক্ষণগুলির সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, যেখানে সীমানায় বৃদ্ধির হার সর্বনিম্ন এবং বিকাশমান ফুলগুলিতে বৃদ্ধির হার সর্বোচ্চ (চিত্র 5a)। প্রিন্সিপাল কম্পোনেন্ট অ্যানালাইসিস (PCA) দেখিয়েছে যে GA সিগন্যালিং অ্যাক্টিভিটি কোষ পৃষ্ঠের বৃদ্ধির তীব্রতার সাথে ঋণাত্মকভাবে সম্পর্কিত ছিল (চিত্র 5c)। আমরা আরও দেখিয়েছি যে, GA সিগন্যালিং ইনপুট এবং বৃদ্ধির তীব্রতা সহ পরিবর্তনের প্রধান অক্ষগুলো উচ্চ CLV3 এক্সপ্রেশন দ্বারা নির্ধারিত দিকের সাথে লম্ব ছিল, যা অবশিষ্ট বিশ্লেষণগুলোতে SAM কেন্দ্র থেকে কোষগুলোকে বাদ দেওয়ার বিষয়টি নিশ্চিত করে। স্পিয়ারম্যান কোরিলেশন বিশ্লেষণ PCA-এর ফলাফলকে নিশ্চিত করেছে (চিত্র 5d), যা নির্দেশ করে যে IPR-এ উচ্চতর GA সিগন্যালের ফলে কোষের প্রসারণ বেশি হয়নি। তবে, কোরিলেশন বিশ্লেষণে GA সিগন্যালিং অ্যাক্টিভিটি এবং গ্রোথ অ্যানাইসোট্রপির মধ্যে একটি সামান্য ধনাত্মক সম্পর্ক প্রকাশ পেয়েছে (চিত্র 5c, d), যা থেকে বোঝা যায় যে IPR-এ উচ্চতর GA সিগন্যালিং কোষ বৃদ্ধির দিক এবং সম্ভবত কোষ বিভাজন তলের অবস্থানকে প্রভাবিত করে।
a, b সাতটি স্বতন্ত্র উদ্ভিদের গড় SAM-এর গড় পৃষ্ঠীয় বৃদ্ধি (a) এবং বৃদ্ধির অ্যানাইসোট্রপি (b)-এর হিট ম্যাপ (যথাক্রমে কোষ প্রসারণের শক্তি এবং দিকের প্রক্সি হিসাবে ব্যবহৃত)। c PCA বিশ্লেষণে নিম্নলিখিত চলকগুলি অন্তর্ভুক্ত ছিল: GA সংকেত, পৃষ্ঠীয় বৃদ্ধির তীব্রতা, পৃষ্ঠীয় বৃদ্ধির অ্যানাইসোট্রপি, এবং CLV3 এক্সপ্রেশন। PCA কম্পোনেন্ট ১ প্রধানত পৃষ্ঠীয় বৃদ্ধির তীব্রতার সাথে নেতিবাচকভাবে এবং GA সংকেতের সাথে ইতিবাচকভাবে সম্পর্কিত ছিল। PCA কম্পোনেন্ট ২ প্রধানত পৃষ্ঠীয় বৃদ্ধির অ্যানাইসোট্রপির সাথে ইতিবাচকভাবে এবং CLV3 এক্সপ্রেশনের সাথে নেতিবাচকভাবে সম্পর্কিত ছিল। শতাংশ প্রতিটি কম্পোনেন্ট দ্বারা ব্যাখ্যা করা তারতম্যকে প্রতিনিধিত্ব করে। d CZ ব্যতীত টিস্যু স্কেলে GA সংকেত, পৃষ্ঠীয় বৃদ্ধির তীব্রতা, এবং পৃষ্ঠীয় বৃদ্ধির অ্যানাইসোট্রপির মধ্যে স্পিয়ারম্যান কোরিলেশন বিশ্লেষণ। ডানদিকের সংখ্যাটি দুটি চলকের মধ্যে স্পিয়ারম্যান রো (rho) মান। তারকাচিহ্নগুলি সেইসব ক্ষেত্র নির্দেশ করে যেখানে কোরিলেশন/নেতিবাচক কোরিলেশন অত্যন্ত তাৎপর্যপূর্ণ। e কনফোকাল মাইক্রোস্কোপি দ্বারা Col-0 SAM L1 কোষের 3D ভিজ্যুয়ালাইজেশন। ১০ ঘণ্টায় SAM-এ (কিন্তু প্রাইমর্ডিয়ামে নয়) গঠিত নতুন কোষ প্রাচীরগুলোকে তাদের কোণের মান অনুযায়ী রঙ করা হয়েছে। কালার বারটি নিচের ডান কোণায় দেখানো হয়েছে। ইনসেটে ০ ঘণ্টার সংশ্লিষ্ট ত্রিমাত্রিক চিত্রটি দেখানো হয়েছে। পরীক্ষাটি দুইবার পুনরাবৃত্তি করা হয়েছিল এবং একই রকম ফলাফল পাওয়া গিয়েছিল। f বক্স প্লটগুলো IPR এবং নন-IPR Col-0 SAM-এর কোষ বিভাজনের হার প্রদর্শন করে (n = ১০টি স্বতন্ত্র উদ্ভিদ)। মাঝের রেখাটি মধ্যক নির্দেশ করে এবং বক্সের সীমানাগুলো ২৫তম ও ৭৫তম পার্সেন্টাইল নির্দেশ করে। হুইস্কারগুলো R সফটওয়্যার দিয়ে নির্ধারিত সর্বনিম্ন ও সর্বোচ্চ মান নির্দেশ করে। P মানগুলো ওয়েলচের দ্বি-পার্শ্বীয় t-পরীক্ষার মাধ্যমে নির্ণয় করা হয়েছিল। g, h পরিকল্পিত চিত্র যা দেখাচ্ছে (g) কীভাবে SAM-এর কেন্দ্র (সাদা ডটেড লাইন) থেকে ব্যাসার্ধ বরাবর নতুন কোষ প্রাচীরের (ম্যাজেন্টা) কোণ পরিমাপ করতে হয় (শুধুমাত্র সূক্ষ্মকোণের মান, অর্থাৎ ০-৯০°, বিবেচনা করা হয়েছে), এবং (h) মেরিস্টেমের অভ্যন্তরে পরিধিগত/পার্শ্বীয় এবং ব্যাসার্ধ বরাবর দিকসমূহ। i যথাক্রমে SAM (গাঢ় নীল), IPR (মাঝারি নীল), এবং নন-IPR (হালকা নীল) জুড়ে কোষ বিভাজন তলের অভিমুখের ফ্রিকোয়েন্সি হিস্টোগ্রাম। P মানগুলো একটি দ্বি-পার্শ্বীয় কোলমোগোরভ-স্মিরনভ পরীক্ষার মাধ্যমে পাওয়া গেছে। পরীক্ষাটি একই রকম ফলাফল সহ দুইবার পুনরাবৃত্তি করা হয়েছিল। j যথাক্রমে P3 (হালকা সবুজ), P4 (মাঝারি সবুজ), এবং P5 (গাঢ় সবুজ)-এর চারপাশে IPR-এর কোষ বিভাজন তলের অভিমুখের ফ্রিকোয়েন্সি হিস্টোগ্রাম। P মানগুলো একটি দ্বি-পার্শ্বীয় কোলমোগোরভ-স্মিরনভ পরীক্ষার মাধ্যমে পাওয়া গেছে। পরীক্ষাটি একই রকম ফলাফল সহ দুইবার পুনরাবৃত্তি করা হয়েছিল।
অতএব, আমরা পরবর্তীকালে পরীক্ষা চলাকালীন নতুন গঠিত কোষ প্রাচীর শনাক্ত করার মাধ্যমে GA সিগন্যালিং এবং কোষ বিভাজন কার্যকলাপের মধ্যে পারস্পরিক সম্পর্ক অনুসন্ধান করি (চিত্র 5e)। এই পদ্ধতিটি আমাদের কোষ বিভাজনের হার এবং দিক পরিমাপ করতে সাহায্য করে। আশ্চর্যজনকভাবে, আমরা দেখতে পাই যে IPR এবং SAM-এর বাকি অংশের (নন-IPR, চিত্র 5f) কোষ বিভাজনের হার একই রকম ছিল, যা নির্দেশ করে যে IPR এবং নন-IPR কোষের মধ্যে GA সিগন্যালিং-এর পার্থক্য কোষ বিভাজনকে উল্লেখযোগ্যভাবে প্রভাবিত করে না। এই বিষয়টি এবং GA সিগন্যালিং ও বৃদ্ধির অ্যানাইসোট্রপির মধ্যে ধনাত্মক পারস্পরিক সম্পর্ক আমাদের এই প্রশ্নটি বিবেচনা করতে উৎসাহিত করে যে GA সিগন্যালিং কার্যকলাপ কোষ বিভাজন তলের অভিমুখকে প্রভাবিত করতে পারে কিনা। আমরা মেরিস্টেম কেন্দ্র এবং নতুন কোষ প্রাচীরের কেন্দ্রকে সংযোগকারী রেডিয়াল অক্ষের সাপেক্ষে নতুন কোষ প্রাচীরের অভিমুখকে একটি সূক্ষ্মকোণ হিসাবে পরিমাপ করেছি (চিত্র 5e-i) এবং লক্ষ্য করেছি যে কোষগুলি রেডিয়াল অক্ষের সাপেক্ষে প্রায় 90° কোণে বিভাজিত হওয়ার একটি স্পষ্ট প্রবণতা দেখায়, যার সর্বোচ্চ হার 70–80° (23.28%) এবং 80–90° (22.62%) কোণে পরিলক্ষিত হয়েছে (চিত্র 5e,i), যা পরিধিগত/অনুপ্রস্থ দিকে কোষ বিভাজনের সাথে সঙ্গতিপূর্ণ (চিত্র 5h)। এই কোষ বিভাজন আচরণে GA সংকেতের অবদান পরীক্ষা করার জন্য, আমরা IPR এবং নন-IPR-এ কোষ বিভাজনের পরামিতিগুলি আলাদাভাবে বিশ্লেষণ করেছি (চিত্র 5i)। আমরা লক্ষ্য করেছি যে IPR কোষগুলিতে বিভাজন কোণের বিন্যাস, নন-IPR কোষ বা সমগ্র SAM-এর কোষগুলির থেকে ভিন্ন ছিল, যেখানে IPR কোষগুলিতে পার্শ্বীয়/বৃত্তাকার কোষ বিভাজনের অনুপাত বেশি ছিল, অর্থাৎ ৭০-৮০° এবং ৮০-৯০° (যথাক্রমে ৩৩.৮৬% এবং ৩০.৭১%, সংশ্লিষ্ট অনুপাত) (চিত্র ৫i)। সুতরাং, আমাদের পর্যবেক্ষণগুলি উচ্চ GA সিগন্যালিং এবং পরিধির দিকের কাছাকাছি কোষ বিভাজন তলের অভিমুখের মধ্যে একটি সম্পর্ক প্রকাশ করেছে, যা GA সিগন্যালিং কার্যকলাপ এবং বৃদ্ধির অ্যানাইসোট্রপির মধ্যেকার পারস্পরিক সম্পর্কের অনুরূপ (চিত্র ৫c, d)। এই সম্পর্কের স্থানিক সংরক্ষণশীলতা আরও প্রতিষ্ঠা করার জন্য, আমরা P3 থেকে শুরু করে প্রিমোর্ডিয়ামকে ঘিরে থাকা IPR কোষগুলিতে বিভাজন তলের অভিমুখ পরিমাপ করেছি, কারণ P4 থেকে শুরু করে এই অঞ্চলে সর্বোচ্চ GA সিগন্যালিং কার্যকলাপ সনাক্ত করা হয়েছিল (চিত্র ৪)। P3 এবং P4-এর আশেপাশের IPR-এর বিভাজন কোণগুলির মধ্যে পরিসংখ্যানগতভাবে কোনো উল্লেখযোগ্য পার্থক্য দেখা যায়নি, যদিও P4-এর আশেপাশের IPR-এ পার্শ্বীয় কোষ বিভাজনের হার বৃদ্ধি লক্ষ্য করা গেছে (চিত্র ৫j)। তবে, P5 এর কাছাকাছি IPR কোষগুলিতে, কোষ বিভাজন তলের অভিমুখের পার্থক্য পরিসংখ্যানগতভাবে তাৎপর্যপূর্ণ হয়ে ওঠে, যেখানে অনুপ্রস্থ কোষ বিভাজনের হার তীব্রভাবে বৃদ্ধি পায় (চিত্র 5j)। সম্মিলিতভাবে, এই ফলাফলগুলি থেকে বোঝা যায় যে GA সিগন্যালিং SAM-এ কোষ বিভাজনের অভিমুখ নিয়ন্ত্রণ করতে পারে, যা পূর্ববর্তী প্রতিবেদনগুলির⁴⁰,⁴¹ সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, যেখানে বলা হয়েছে যে উচ্চ GA সিগন্যালিং IPR-এ কোষ বিভাজনের পার্শ্বীয় অভিমুখ প্ররোচিত করতে পারে।
ধারণা করা হয় যে IPR-এর কোষগুলো প্রিমোর্ডিয়াতে অন্তর্ভুক্ত না হয়ে বরং ইন্টারনোডে অন্তর্ভুক্ত হবে২,৪২,৪৩। IPR-এ কোষ বিভাজনের অনুপ্রস্থ অভিমুখের ফলে ইন্টারনোডে এপিডার্মাল কোষের সমান্তরাল অনুদৈর্ঘ্য সারির সাধারণ বিন্যাস দেখা যেতে পারে। উপরে বর্ণিত আমাদের পর্যবেক্ষণগুলো থেকে বোঝা যায় যে, GA সিগন্যালিং সম্ভবত কোষ বিভাজনের দিক নিয়ন্ত্রণের মাধ্যমে এই প্রক্রিয়ায় একটি ভূমিকা পালন করে।
বেশ কয়েকটি DELLA জিনের কার্যকারিতা হারানোর ফলে একটি কনস্টিটিউটিভ GA প্রতিক্রিয়া দেখা যায়, এবং এই হাইপোথিসিসটি পরীক্ষা করার জন্য della মিউট্যান্ট ব্যবহার করা যেতে পারে44। আমরা প্রথমে SAM-এ পাঁচটি DELLA জিনের এক্সপ্রেশন প্যাটার্ন বিশ্লেষণ করেছি। GUS লাইনের45 ট্রান্সক্রিপশনাল ফিউশন থেকে দেখা গেছে যে GAI, RGA, RGL1, এবং RGL2 (অনেক কম পরিমাণে) SAM-এ প্রকাশিত হয়েছিল (পরিপূরক চিত্র 11a–d)। ইন সিটু হাইব্রিডাইজেশন আরও দেখিয়েছে যে GAI mRNA বিশেষভাবে প্রিমোর্ডিয়া এবং বিকাশমান ফুলে জমা হয় (পরিপূরক চিত্র 11e)। RGL1 এবং RGL3 mRNA পুরো SAM ক্যানোপি জুড়ে এবং পুরোনো ফুলে সনাক্ত করা হয়েছিল, যেখানে RGL2 mRNA সীমান্ত অঞ্চলে বেশি পরিমাণে ছিল (পরিপূরক চিত্র 11f–h)। pRGL3::RGL3-GFP SAM-এর কনফোকাল ইমেজিং ইন সিটু হাইব্রিডাইজেশন দ্বারা পর্যবেক্ষণ করা এক্সপ্রেশনকে নিশ্চিত করেছে এবং দেখিয়েছে যে RGL3 প্রোটিন SAM-এর কেন্দ্রীয় অংশে জমা হয় (পরিপূরক চিত্র 11i)। pRGA::GFP-RGA লাইনটি ব্যবহার করে আমরা আরও দেখতে পাই যে, RGA প্রোটিন SAM-এ জমা হয়, কিন্তু P4 থেকে শুরু করে সীমান্তে এর প্রাচুর্য হ্রাস পায় (পরিপূরক চিত্র 11j)। উল্লেখযোগ্যভাবে, RGL3 এবং RGA-এর এক্সপ্রেশন প্যাটার্ন IPR-এ উচ্চতর GA সিগন্যালিং অ্যাক্টিভিটির সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, যা qmRGA দ্বারা শনাক্ত করা হয়েছে (চিত্র 4)। অধিকন্তু, এই তথ্যগুলো নির্দেশ করে যে সমস্ত DELLA-ই SAM-এ প্রকাশিত হয় এবং তাদের সম্মিলিত এক্সপ্রেশন সমগ্র SAM জুড়ে বিস্তৃত থাকে।
এরপর আমরা ওয়াইল্ড-টাইপ SAM (Ler, কন্ট্রোল) এবং gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della কুইন্টুপল (গ্লোবাল) মিউট্যান্টের কোষ বিভাজন প্যারামিটারগুলো বিশ্লেষণ করেছি (চিত্র ৬ক, খ)। মজার বিষয় হলো, আমরা ওয়াইল্ড-টাইপের তুলনায় della গ্লোবাল মিউট্যান্ট SAM-এ কোষ বিভাজন কোণের ফ্রিকোয়েন্সির বণ্টনে একটি পরিসংখ্যানগতভাবে তাৎপর্যপূর্ণ পরিবর্তন লক্ষ্য করেছি (চিত্র ৬গ)। della গ্লোবাল মিউট্যান্টে এই পরিবর্তনটি ৮০–৯০° কোণের (৩৪.৭১% বনাম ২৪.৫৫%) এবং কিছুটা কম পরিমাণে ৭০–৮০° কোণের (২৩.৭৮% বনাম ২০.১৮%) ফ্রিকোয়েন্সি বৃদ্ধির কারণে ঘটেছে, অর্থাৎ, যা অনুপ্রস্থ কোষ বিভাজনের সাথে সঙ্গতিপূর্ণ (চিত্র ৬গ)। della গ্লোবাল মিউট্যান্টে অ-অনুপ্রস্থ বিভাজনের (০–৬০°) ফ্রিকোয়েন্সিও কম ছিল (চিত্র ৬গ)। ডেলা গ্লোবাল মিউট্যান্টের SAM-এ অনুপ্রস্থ কোষ বিভাজনের হার উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছিল (চিত্র ৬খ)। ওয়াইল্ড টাইপের তুলনায় ডেলা গ্লোবাল মিউট্যান্টের IPR-এও অনুপ্রস্থ কোষ বিভাজনের হার বেশি ছিল (চিত্র ৬ঘ)। IPR অঞ্চলের বাইরে, ওয়াইল্ড টাইপে কোষ বিভাজন কোণগুলোর বিন্যাস অধিকতর সুষম ছিল, অপরদিকে ডেলা গ্লোবাল মিউট্যান্ট IPR-এর মতো স্পর্শকীয় বিভাজন পছন্দ করত (চিত্র ৬ঙ)। আমরা ga2 অক্সিডেজ (ga2ox) কুইন্টুপল মিউট্যান্টগুলোর (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, এবং ga2ox6-2) SAM-এ কোষ বিভাজনের অভিমুখও পরিমাপ করেছি, যা একটি GA-নিষ্ক্রিয় মিউট্যান্ট ব্যাকগ্রাউন্ড যেখানে GA সঞ্চিত হয়। GA-এর মাত্রা বৃদ্ধির সাথে সঙ্গতি রেখে, পঞ্চগুণ ga2ox মিউট্যান্ট পুষ্পমঞ্জরির SAM, Col-0-এর চেয়ে বড় ছিল (পরিপূরক চিত্র 12a, b), এবং Col-0-এর তুলনায়, পঞ্চগুণ ga2ox SAM কোষ বিভাজন কোণের একটি সুস্পষ্টভাবে ভিন্ন বিন্যাস প্রদর্শন করে, যেখানে কোণের হার 50° থেকে 90° পর্যন্ত বৃদ্ধি পায়, অর্থাৎ এটি আবারও স্পর্শকীয় বিভাজনকে উৎসাহিত করে (পরিপূরক চিত্র 12a–c)। সুতরাং, আমরা দেখাচ্ছি যে GA সংকেতের ধারাবাহিক সক্রিয়করণ এবং GA-এর সঞ্চয়ন IPR এবং SAM-এর বাকি অংশে পার্শ্বীয় কোষ বিভাজনকে প্ররোচিত করে।
ক, খ কনফোকাল মাইক্রোস্কোপি ব্যবহার করে PI-রঞ্জিত Ler (ক) এবং গ্লোবাল ডেলা মিউট্যান্ট (খ) SAM-এর L1 স্তরের ত্রিমাত্রিক দৃশ্যায়ন। ১০-ঘণ্টা সময়কালে SAM-এ (কিন্তু প্রাইমর্ডিয়ামে নয়) গঠিত নতুন কোষ প্রাচীরগুলো দেখানো হয়েছে এবং তাদের কোণের মান অনুযায়ী রঙ করা হয়েছে। ইনসেটে ০ ঘণ্টার SAM দেখানো হয়েছে। কালার বারটি নিচের ডান কোণায় প্রদর্শিত হয়েছে। (খ)-এর তীরচিহ্নটি গ্লোবাল ডেলা মিউট্যান্টে সারিবদ্ধ কোষ সারির একটি উদাহরণ নির্দেশ করে। পরীক্ষাটি একই রকম ফলাফল সহ দুইবার পুনরাবৃত্তি করা হয়েছিল। গ) Ler এবং গ্লোবাল ডেলার মধ্যে সম্পূর্ণ SAM (ঘ), IPR (ঙ), এবং নন-IPR (চ)-এ কোষ বিভাজন তলের অভিমুখের ফ্রিকোয়েন্সি ডিস্ট্রিবিউশনের তুলনা। দ্বি-পুচ্ছ কোলমোগোরভ-স্মিরনভ পরীক্ষা ব্যবহার করে P মানগুলো পাওয়া গেছে। f, g Col-0 (i) এবং pCUC2::gai-1-VENUS (j) ট্রান্সজেনিক উদ্ভিদের PI-রঞ্জিত SAM-এর কনফোকাল চিত্রের ত্রিমাত্রিক দৃশ্যায়ন। প্যানেল (a, b) ১০ ঘণ্টার মধ্যে SAM-এ গঠিত নতুন কোষ প্রাচীর (কিন্তু প্রাইমর্ডিয়া নয়) দেখায়। পরীক্ষাটি একই রকম ফলাফল সহ দুইবার পুনরাবৃত্তি করা হয়েছিল। h–j Col-0 এবং pCUC2::gai-1-VENUS উদ্ভিদের মধ্যে সম্পূর্ণ SAM (h), IPR (i) এবং নন-IPR (j)-এ অবস্থিত কোষ বিভাজন তলের অভিমুখের পৌনঃপুনিকতার তুলনা। দ্বি-পার্শ্বীয় কোলমোগোরভ-স্মিরনভ পরীক্ষা ব্যবহার করে P মানগুলি পাওয়া গেছে।
এরপর আমরা বিশেষভাবে IPR-এ GA সিগন্যালিং বাধা দেওয়ার প্রভাব পরীক্ষা করি। এই উদ্দেশ্যে, আমরা VENUS-এর সাথে সংযুক্ত একটি ডমিন্যান্ট নেগেটিভ gai-1 প্রোটিনের এক্সপ্রেশন চালনা করার জন্য কটিলেডন কাপ 2 (CUC2) প্রোমোটার ব্যবহার করি (pCUC2::gai-1-VENUS লাইনে)। ওয়াইল্ড-টাইপ SAM-এ, CUC2 প্রোমোটার P4 থেকে শুরু করে SAM-এর বেশিরভাগ IPR-এর, যার মধ্যে বর্ডার সেলও অন্তর্ভুক্ত, এক্সপ্রেশন চালনা করে এবং pCUC2::gai-1-VENUS উদ্ভিদেও অনুরূপ নির্দিষ্ট এক্সপ্রেশন পরিলক্ষিত হয় (নিচে দেখুন)। pCUC2::gai-1-VENUS উদ্ভিদের SAM বা IPR জুড়ে কোষ বিভাজন কোণের বিন্যাস ওয়াইল্ড-টাইপের থেকে উল্লেখযোগ্যভাবে ভিন্ন ছিল না, যদিও অপ্রত্যাশিতভাবে আমরা দেখতে পাই যে এই উদ্ভিদগুলিতে IPR বিহীন কোষগুলি ৮০-৯০° কোণে উচ্চতর হারে বিভাজিত হয় (চিত্র ৬f–j)।
ধারণা করা হয় যে কোষ বিভাজনের দিক SAM-এর জ্যামিতির উপর নির্ভর করে, বিশেষ করে টিস্যুর বক্রতা দ্বারা সৃষ্ট টান চাপের উপর। তাই আমরা জানতে চেয়েছিলাম যে della গ্লোবাল মিউট্যান্ট এবং pCUC2::gai-1-VENUS উদ্ভিদে SAM-এর আকৃতি পরিবর্তিত হয়েছে কিনা। পূর্বে যেমন রিপোর্ট করা হয়েছে, della গ্লোবাল মিউট্যান্টের SAM-এর আকার ওয়াইল্ড টাইপের চেয়ে বড় ছিল (পরিপূরক চিত্র 13a, b, d)। CLV3 এবং STM RNA-এর ইন সিটু হাইব্রিডাইজেশন della মিউট্যান্টে মেরিস্টেমের প্রসারণ নিশ্চিত করেছে এবং স্টেম সেল নিশের পার্শ্বীয় প্রসারণও দেখিয়েছে (পরিপূরক চিত্র 13e, f, h, i)। তবে, উভয় জিনোটাইপে SAM-এর বক্রতা একই রকম ছিল (পরিপূরক চিত্র 13k, m, n, p)। আমরা ওয়াইল্ড টাইপের তুলনায় gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della কোয়াড্রাপল মিউট্যান্টে বক্রতার কোনো পরিবর্তন ছাড়াই আকারের অনুরূপ বৃদ্ধি লক্ষ্য করেছি (পরিপূরক চিত্র ১৩গ, ঘ, ছ, জ, ল, ও, প)। della কোয়াড্রাপল মিউট্যান্টে কোষ বিভাজনের অভিমুখের হারও প্রভাবিত হয়েছিল, কিন্তু della মনোলিথিক মিউট্যান্টের তুলনায় তা কম মাত্রায় (পরিপূরক চিত্র ১২ঘ-চ)। এই ডোসেজ এফেক্ট, এবং এর সাথে বক্রতার উপর কোনো প্রভাব না থাকা, এই ইঙ্গিত দেয় যে Della কোয়াড্রাপল মিউট্যান্টে অবশিষ্ট RGL3 অ্যাক্টিভিটি, DELLA অ্যাক্টিভিটি হারানোর কারণে সৃষ্ট কোষ বিভাজনের অভিমুখের পরিবর্তনকে সীমিত করে এবং পার্শ্বীয় কোষ বিভাজনের পরিবর্তনগুলো SAM জ্যামিতির পরিবর্তনের পরিবর্তে GA সিগন্যালিং অ্যাক্টিভিটির পরিবর্তনের প্রতিক্রিয়ায় ঘটে। উপরে বর্ণিত হিসাবে, CUC2 প্রোমোটার P4 থেকে SAM-এ IPR এক্সপ্রেশন চালনা করে (পরিপূরক চিত্র 14a, b), এবং এর বিপরীতে, pCUC2::gai-1-VENUS SAM-এর আকার হ্রাস পেলেও বক্রতা বেশি ছিল (পরিপূরক চিত্র 14c–h)। pCUC2::gai-1-VENUS SAM-এর গঠনগত এই পরিবর্তনের ফলে ওয়াইল্ড টাইপের তুলনায় যান্ত্রিক পীড়নের একটি ভিন্ন বন্টন হতে পারে, যেখানে উচ্চ পরিধীয় পীড়ন SAM কেন্দ্র থেকে কম দূরত্বে শুরু হয়47। বিকল্পভাবে, pCUC2::gai-1-VENUS SAM-এর গঠনগত পরিবর্তনগুলি ট্রান্সজিন এক্সপ্রেশনের দ্বারা প্ররোচিত আঞ্চলিক যান্ত্রিক বৈশিষ্ট্যের পরিবর্তনের ফলেও হতে পারে48। উভয় ক্ষেত্রেই, এটি কোষগুলির পরিধীয়/আড়াআড়ি দিকে বিভাজিত হওয়ার সম্ভাবনা বাড়িয়ে GA সিগন্যালিং-এর পরিবর্তনের প্রভাবগুলিকে আংশিকভাবে প্রশমিত করতে পারে, যা আমাদের পর্যবেক্ষণগুলিকে ব্যাখ্যা করে।
সামগ্রিকভাবে, আমাদের উপাত্ত নিশ্চিত করে যে উচ্চতর GA সংকেত IPR-এ কোষ বিভাজন তলের পার্শ্বীয় অভিমুখীকরণে একটি সক্রিয় ভূমিকা পালন করে। এ থেকে আরও দেখা যায় যে, মেরিস্টেমের বক্রতাও IPR-এ কোষ বিভাজন তলের অভিমুখীকরণকে প্রভাবিত করে।
উচ্চ GA সিগন্যালিং কার্যকলাপের কারণে IPR-এ বিভাজন তলের অনুপ্রস্থ অভিমুখীকরণ থেকে বোঝা যায় যে, GA SAM-এর মধ্যে এপিডার্মিসে একটি ব্যাসার্ধীয় কোষ সারিকে পূর্ব-সংগঠিত করে, যা পরবর্তীতে এপিডার্মাল ইন্টারনোডে পাওয়া যাবে এমন কোষীয় বিন্যাসকে সংজ্ঞায়িত করে। প্রকৃতপক্ষে, della global মিউট্যান্টদের SAM চিত্রগুলিতে এই ধরনের কোষ সারি প্রায়শই দৃশ্যমান ছিল (চিত্র 6b)। সুতরাং, SAM-এ GA সিগন্যালিং-এর স্থানিক বিন্যাসের বিকাশগত কার্যকারিতা আরও অন্বেষণ করার জন্য, আমরা ওয়াইল্ড-টাইপ (Ler এবং Col-0), della global মিউট্যান্ট এবং pCUC2::gai-1-VENUS ট্রান্সজেনিক উদ্ভিদের IPR-এ কোষের স্থানিক বিন্যাস বিশ্লেষণ করতে টাইম-ল্যাপস ইমেজিং ব্যবহার করেছি।
আমরা দেখতে পাই যে qmRGA দেখিয়েছে, IPR-এ GA সিগন্যালিং কার্যকলাপ P1/P2 থেকে বৃদ্ধি পেয়ে P4-এ সর্বোচ্চ পর্যায়ে পৌঁছায় এবং এই প্যাটার্নটি সময়ের সাথে সাথে অপরিবর্তিত থাকে (চিত্র ৪ক–চ এবং পরিপূরক চিত্র ৮গ–চ, ক)। ক্রমবর্ধমান GA সিগন্যালের সাথে IPR-এ কোষের স্থানিক বিন্যাস বিশ্লেষণ করার জন্য, আমরা প্রথম পর্যবেক্ষণের ৩৪ ঘণ্টা পর, অর্থাৎ দুই প্লাস্টিড সময়েরও বেশি সময় পর, P4-এর উপরে এবং পাশে থাকা Ler IPR কোষগুলোকে তাদের বিকাশের পরিণতি অনুসারে চিহ্নিত করি, যা আমাদের P1/P2 থেকে P4 পর্যন্ত প্রিমোর্ডিয়ামের বিকাশের সময় IPR কোষগুলোকে অনুসরণ করতে সাহায্য করে। আমরা তিনটি ভিন্ন রঙ ব্যবহার করেছি: P4-এর কাছাকাছি প্রিমোর্ডিয়ামে একীভূত হওয়া কোষগুলোর জন্য হলুদ, IPR-এ থাকা কোষগুলোর জন্য সবুজ এবং উভয় প্রক্রিয়ায় অংশগ্রহণকারী কোষগুলোর জন্য বেগুনি (চিত্র ৭ক–গ)। t0 (০ ঘণ্টা)-তে, P4-এর সামনে IPR কোষের ১-২টি স্তর দৃশ্যমান ছিল (চিত্র ৭ক)। প্রত্যাশিতভাবেই, যখন এই কোষগুলো বিভাজিত হয়েছিল, তখন তারা প্রধানত অনুপ্রস্থ বিভাজন তল বরাবরই বিভাজিত হয় (চিত্র ৭ক–গ)। Col-0 SAM ব্যবহার করেও অনুরূপ ফলাফল পাওয়া গেছে (P3-এর উপর দৃষ্টি নিবদ্ধ করে, যার কিনারা Ler-এর P4-এর মতো ভাঁজ হয়), যদিও এই জিনোটাইপে পুষ্পের কিনারায় গঠিত ভাঁজটি IPR কোষগুলোকে আরও দ্রুত আড়াল করে ফেলে (চিত্র ৭ছ–ঝ)। সুতরাং, IPR কোষের বিভাজন বিন্যাস পর্বমধ্যের মতো কোষগুলোকে ব্যাসার্ধ বরাবর সারিতে পূর্ব-বিন্যস্ত করে। ব্যাসার্ধ বরাবর সারির এই বিন্যাস এবং পরপর অঙ্গগুলোর মধ্যে IPR কোষের অবস্থান থেকে বোঝা যায় যে এই কোষগুলো পর্বমধ্যের পূর্বসূরী।
এখানে, আমরা একটি রেশিওমেট্রিক GA সিগন্যালিং বায়োসেন্সর, qmRGA, তৈরি করেছি, যা অন্তঃস্থ সিগন্যালিং পথগুলির সাথে হস্তক্ষেপ কমিয়ে GA এবং GA রিসেপ্টরের সম্মিলিত ঘনত্বের ফলে সৃষ্ট GA সিগন্যালিং কার্যকলাপের পরিমাণগত ম্যাপিং করতে সক্ষম, যার ফলে কোষীয় স্তরে GA-এর কার্যকারিতা সম্পর্কে তথ্য প্রদান করে। এই লক্ষ্যে, আমরা একটি পরিবর্তিত DELLA প্রোটিন, mRGA, তৈরি করেছি, যা DELLA ইন্টারঅ্যাকশন পার্টনারদের সাথে আবদ্ধ হওয়ার ক্ষমতা হারিয়েছে কিন্তু GA-প্ররোচিত প্রোটিওলাইসিসের প্রতি সংবেদনশীল রয়েছে। qmRGA GA স্তরের বাহ্যিক এবং অন্তঃস্থ উভয় পরিবর্তনেই সাড়া দেয়, এবং এর গতিশীল সংবেদনশীল বৈশিষ্ট্যগুলি বিকাশের সময় GA সিগন্যালিং কার্যকলাপের স্থানকালিক পরিবর্তনগুলি মূল্যায়ন করতে সক্ষম করে। qmRGA একটি অত্যন্ত নমনীয় সরঞ্জামও বটে কারণ এর এক্সপ্রেশনের জন্য ব্যবহৃত প্রোমোটার পরিবর্তন করে (প্রয়োজনে) এটিকে বিভিন্ন টিস্যুর জন্য অভিযোজিত করা যেতে পারে, এবং অ্যাঞ্জিওস্পার্ম জুড়ে GA সিগন্যালিং পথ এবং PFYRE মোটিফের সংরক্ষিত প্রকৃতির কারণে, এটি অন্যান্য প্রজাতিতেও স্থানান্তরযোগ্য হওয়ার সম্ভাবনা রয়েছে। এর সাথে সঙ্গতি রেখে, ধানের SLR1 DELLA প্রোটিনে একটি সমতুল্য মিউটেশন (HYY497AAA) SLR1-এর বৃদ্ধি দমনকারী কার্যকলাপকে দমন করতে দেখা গেছে, যখন এটি mRGA23-এর মতো GA-মধ্যস্থ অবক্ষয়কে সামান্যই হ্রাস করে। উল্লেখযোগ্যভাবে, অ্যারাবিডোপসিসে সাম্প্রতিক গবেষণায় দেখা গেছে যে PFYRE ডোমেনে একটি একক অ্যামিনো অ্যাসিড মিউটেশন (S474L) ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর অংশীদারদের সাথে মিথস্ক্রিয়া করার ক্ষমতাকে প্রভাবিত না করেই RGA-এর ট্রান্সক্রিপশনাল কার্যকলাপ পরিবর্তন করেছে50। যদিও এই মিউটেশনটি mRGA-তে উপস্থিত ৩টি অ্যামিনো অ্যাসিড প্রতিস্থাপনের খুব কাছাকাছি, আমাদের গবেষণা দেখায় যে এই দুটি মিউটেশন DELLA-এর স্বতন্ত্র বৈশিষ্ট্য পরিবর্তন করে। যদিও বেশিরভাগ ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর অংশীদার DELLA26,51-এর LHR1 এবং SAW ডোমেনে আবদ্ধ হয়, PFYRE ডোমেনের কিছু সংরক্ষিত অ্যামিনো অ্যাসিড এই মিথস্ক্রিয়াগুলিকে স্থিতিশীল করতে সাহায্য করতে পারে।
উদ্ভিদের গঠন ও ফলন বৃদ্ধিতে পর্বমধ্যের বিকাশ একটি গুরুত্বপূর্ণ বৈশিষ্ট্য। qmRGA IPR পর্বমধ্যের পূর্বসূরী কোষে উচ্চতর GA সংকেত সক্রিয়তা প্রকাশ করেছে। পরিমাণগত ইমেজিং এবং জেনেটিক্সের সমন্বয়ে, আমরা দেখিয়েছি যে GA সংকেত বিন্যাস SAM এপিডার্মিসে বৃত্তাকার/আড়াআড়ি কোষ বিভাজন তলের উপর আরোপিত হয়, যা পর্বমধ্যের বিকাশের জন্য প্রয়োজনীয় কোষ বিভাজন বিন্যাসকে আকার দেয়। বিকাশের সময় কোষ বিভাজন তলের অভিমুখের বেশ কিছু নিয়ন্ত্রক চিহ্নিত করা হয়েছে৫২,৫৩। আমাদের কাজটি GA সংকেত সক্রিয়তা কীভাবে এই কোষীয় পরামিতিকে নিয়ন্ত্রণ করে তার একটি স্পষ্ট উদাহরণ প্রদান করে। DELLA প্রিফোল্ডিং প্রোটিন কমপ্লেক্সের সাথে মিথস্ক্রিয়া করতে পারে৪১, তাই GA সংকেত সরাসরি কর্টিক্যাল মাইক্রোটিউবিউলের অভিমুখকে প্রভাবিত করে কোষ বিভাজন তলের অভিমুখ নিয়ন্ত্রণ করতে পারে৪০,৪১,৫৪,৫৫। আমরা অপ্রত্যাশিতভাবে দেখিয়েছি যে SAM-এ, উচ্চতর GA সংকেত সক্রিয়তার সাথে কোষের প্রসারণ বা বিভাজনের কোনো সম্পর্ক ছিল না, বরং শুধুমাত্র বৃদ্ধির অ্যানাইসোট্রপির সম্পর্ক ছিল, যা IPR-এ কোষ বিভাজনের অভিমুখের উপর GA-এর সরাসরি প্রভাবের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ। তবে, আমরা এই সম্ভাবনা বাদ দিতে পারি না যে এই প্রভাব পরোক্ষও হতে পারে, উদাহরণস্বরূপ GA-প্ররোচিত কোষ প্রাচীরের কোমলকরণের মাধ্যমে ৫৬। কোষ প্রাচীরের বৈশিষ্ট্যের পরিবর্তন যান্ত্রিক চাপ সৃষ্টি করে⁵⁷,⁵⁸, যা কর্টিক্যাল মাইক্রোটিউবিউলের অভিমুখকে প্রভাবিত করার মাধ্যমে কোষ বিভাজন তলের অভিমুখকেও প্রভাবিত করতে পারে³⁹,⁴⁶,⁵⁹। GA-প্ররোচিত যান্ত্রিক চাপ এবং GA দ্বারা মাইক্রোটিউবিউলের অভিমুখের প্রত্যক্ষ নিয়ন্ত্রণের সম্মিলিত প্রভাব ইন্টারনোড নির্ধারণের জন্য IPR-এ কোষ বিভাজনের অভিমুখের একটি নির্দিষ্ট বিন্যাস তৈরিতে জড়িত থাকতে পারে, এবং এই ধারণাটি যাচাই করার জন্য আরও গবেষণার প্রয়োজন। একইভাবে, পূর্ববর্তী গবেষণায় ইন্টারনোড গঠন নিয়ন্ত্রণে DELLA-এর সাথে মিথস্ক্রিয়াকারী প্রোটিন TCP¹⁴ এবং ¹⁵-এর গুরুত্ব তুলে ধরা হয়েছে⁶⁰,⁶¹ এবং এই উপাদানগুলো BREVIPEDICELLUS (BP) এবং PENNYWISE (PNY)-এর সাথে একত্রে GA-এর ক্রিয়াকে মধ্যস্থতা করতে পারে, যা ইন্টারনোডের বিকাশ নিয়ন্ত্রণ করে এবং GA সংকেতকে প্রভাবিত করে বলে দেখানো হয়েছে²,⁶²। যেহেতু DELLA-গুলি ব্রাসিনোস্টেরয়েড, ইথিলিন, জ্যাসমোনিক অ্যাসিড এবং অ্যাবসিসিক অ্যাসিড (ABA) সিগন্যালিং পাথওয়ের সাথে মিথস্ক্রিয়া করে63,64 এবং এই হরমোনগুলি মাইক্রোটিউবিউলের অভিমুখকে প্রভাবিত করতে পারে65, তাই কোষ বিভাজনের অভিমুখের উপর GA-এর প্রভাব অন্যান্য হরমোনের মাধ্যমেও মধ্যস্থতা লাভ করতে পারে।
প্রাথমিক কোষবিদ্যা সংক্রান্ত গবেষণায় দেখা গেছে যে অ্যারাবিডোপসিস এসএএম-এর অভ্যন্তরীণ এবং বাহ্যিক উভয় অঞ্চলই পর্বমধ্য বিকাশের জন্য প্রয়োজন²,⁴²। অভ্যন্তরীণ টিস্যুতে GA যে সক্রিয়ভাবে কোষ বিভাজন নিয়ন্ত্রণ করে¹², তা এসএএম-এ মেরিস্টেম এবং পর্বমধ্যের আকার নিয়ন্ত্রণে GA-এর দ্বৈত ভূমিকাকে সমর্থন করে। অভ্যন্তরীণ এসএএম টিস্যুতে দিকনির্দেশক কোষ বিভাজনের ধরণও কঠোরভাবে নিয়ন্ত্রিত হয়, এবং এই নিয়ন্ত্রণ কাণ্ডের বৃদ্ধির জন্য অপরিহার্য⁵²। এটি পরীক্ষা করা আকর্ষণীয় হবে যে GA অভ্যন্তরীণ এসএএম গঠনে কোষ বিভাজন তলকে অভিমুখী করতেও ভূমিকা পালন করে কিনা, যার ফলে এসএএম-এর মধ্যে পর্বমধ্যের নির্দিষ্টকরণ এবং বিকাশ সমন্বিত হয়।
হাইপোকোটাইল এবং মূল বৃদ্ধির পরীক্ষা ব্যতীত, উদ্ভিদগুলিকে আদর্শ পরিস্থিতিতে (১৬ ঘণ্টা আলো, ২২ °C) মাটিতে অথবা ১% সুক্রোজ এবং ১% অ্যাগার (সিগমা) সহযোগে ১x মুরাশিগে-স্কুগ (এমএস) মাধ্যমে ইন ভিট্রো পদ্ধতিতে চাষ করা হয়েছিল। হাইপোকোটাইল এবং মূল বৃদ্ধির পরীক্ষাগুলির ক্ষেত্রে চারাগাছগুলিকে উল্লম্ব প্লেটে স্থির আলো এবং ২২ °C তাপমাত্রায় চাষ করা হয়েছিল। নাইট্রেট পরীক্ষার জন্য, উদ্ভিদগুলিকে দীর্ঘ-দিবসের পরিস্থিতিতে পর্যাপ্ত নাইট্রেট (০ বা ১০ mM KNO3), ০.৫ mM NH4-সাক্সিনেট, ১% সুক্রোজ এবং ১% এ-অ্যাগার (সিগমা) সহযোগে পরিবর্তিত এমএস মাধ্যমে (বায়োওয়ার্ল্ড প্ল্যান্ট মিডিয়াম) চাষ করা হয়েছিল।
pDONR221-এ GID1a cDNA সন্নিবেশ করে, সেটিকে pDONR P4-P1R-pUBQ10 এবং pDONR P2R-P3-mCherry-এর সাথে pB7m34GW-তে পুনঃসংযোজনের মাধ্যমে pUBQ10::GID1a-mCherry তৈরি করা হয়। pDONR221-এ IDD2 DNA সন্নিবেশ করে, সেটিকে pB7RWG266-তে পুনঃসংযোজনের মাধ্যমে p35S:IDD2-RFP তৈরি করা হয়। pGID1b::2xmTQ2-GID1b তৈরি করার জন্য, প্রথমে সাপ্লিমেন্টারি টেবিল ৩-এ থাকা প্রাইমার ব্যবহার করে GID1b কোডিং অঞ্চলের আপস্ট্রিমের একটি ৩.৯ kb খণ্ড এবং GID1b cDNA (১.৩ kb) ও টার্মিনেটর (৩.৪ kb) ধারণকারী একটি ৪.৭ kb খণ্ডকে অ্যামপ্লিফাই করা হয়। এরপর সেগুলোকে যথাক্রমে pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) এবং pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific)-এ ইনসার্ট করা হয় এবং সবশেষে গেটওয়ে ক্লোনিং ব্যবহার করে pDONR221 2xmTQ268-এর সাথে পুনঃসংযোজিত করে pGreen 012567 টার্গেট ভেক্টরে স্থাপন করা হয়। pCUC2::LSSmOrange তৈরি করার জন্য, CUC2 প্রোমোটার সিকোয়েন্স (ATG-এর ৩২২৯ bp উজানে) এবং এর পরে N7 নিউক্লিয়ার লোকালাইজেশন সিগন্যাল ও NOS ট্রান্সক্রিপশনাল টার্মিনেটর সহ লার্জ স্টোকস-শিফটেড mOrange (LSSmOrange)69-এর কোডিং সিকোয়েন্সকে Gateway 3-ফ্র্যাগমেন্ট রিকম্বিনেশন সিস্টেম (Invitrogen) ব্যবহার করে pGreen কানামাইসিন টার্গেটিং ভেক্টরে একত্রিত করা হয়েছিল। প্ল্যান্ট বাইনারি ভেক্টরটি যথাক্রমে Agrobacterium tumefaciens স্ট্রেইন GV3101-এ প্রবেশ করানো হয়েছিল এবং Agrobacterium ইনফিলট্রেশন পদ্ধতিতে Nicotiana benthamiana-র পাতায় ও ফ্লোরাল ডিপ পদ্ধতিতে Arabidopsis thaliana Col-0-তে প্রবেশ করানো হয়েছিল। pUBQ10::qmRGA, pUBQ10::GID1a-mCherry এবং pCLV3::mCherry-NLS qmRGA যথাক্রমে সংশ্লিষ্ট ক্রসগুলোর F3 এবং F1 বংশধর থেকে পৃথক করা হয়েছিল।
প্রায় ১ সেমি লম্বা শুট টিপস৭২-এর উপর আরএনএ ইন সিটু হাইব্রিডাইজেশন করা হয়েছিল, যেগুলো সংগ্রহ করে অবিলম্বে ৪ °C তাপমাত্রায় আগে থেকে ঠান্ডা করা এফএএ দ্রবণে (৩.৭% ফর্মালডিহাইড, ৫% অ্যাসিটিক অ্যাসিড, ৫০% ইথানল) ফিক্স করা হয়েছিল। ২ × ১৫ মিনিটের ভ্যাকুয়াম ট্রিটমেন্টের পর, ফিক্সেটিভ পরিবর্তন করা হয়েছিল এবং নমুনাগুলো সারারাত ইনকিউবেট করা হয়েছিল। রোজিয়ার এট আল.৭৩ দ্বারা বর্ণিত পদ্ধতি অনুসারে, সাপ্লিমেন্টারি টেবিল ৩-এ দেখানো প্রাইমার ব্যবহার করে GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, এবং RGL3 সিডিএনএ এবং তাদের ৩′-ইউটিআর-এর অ্যান্টিসেন্স প্রোব সংশ্লেষণ করা হয়েছিল। ডিগোক্সিজেনিন অ্যান্টিবডি (৩০০০-গুণ লঘুকৃত; রোশ, ক্যাটালগ নম্বর: ১১ ০৯৩ ২৭৪ ৯১০) ব্যবহার করে ডিগোক্সিজেনিন-লেবেলযুক্ত প্রোবগুলোর ইমিউনোডিটেক্টিং করা হয়েছিল, এবং সেকশনগুলোকে ৫-ব্রোমো-৪-ক্লোরো-৩-ইন্ডোলিল ফসফেট (বিসিআইপি, ২৫০-গুণ লঘুকৃত)/নাইট্রোব্লু টেট্রাজোলিয়াম (এনবিটি, ২০০-গুণ লঘুকৃত) দ্রবণ দিয়ে স্টেইন করা হয়েছিল।