কৃমিনাশক ওষুধ N,N-ডাইথাইল-m-টুলুয়ামাইড (DEET সম্পর্কে) ACHE (acetylcholinesterase) কে বাধা দেয় বলে জানা গেছে এবং অতিরিক্ত ভাস্কুলারাইজেশনের কারণে এর সম্ভাব্য কার্সিনোজেনিক বৈশিষ্ট্য রয়েছে। এই গবেষণাপত্রে, আমরা দেখাই যে DEET বিশেষভাবে এন্ডোথেলিয়াল কোষগুলিকে উদ্দীপিত করে যা অ্যাঞ্জিওজেনেসিসকে উৎসাহিত করে, যার ফলে টিউমারের বৃদ্ধি বৃদ্ধি পায়। DEET কোষীয় প্রক্রিয়াগুলিকে সক্রিয় করে যা অ্যাঞ্জিওজেনেসিসের দিকে পরিচালিত করে, যার মধ্যে রয়েছে প্রসারণ, স্থানান্তর এবং আঠালোকরণ। এটি এন্ডোথেলিয়াল কোষগুলিতে NO উৎপাদন এবং VEGF প্রকাশ বৃদ্ধির সাথে সম্পর্কিত। M3 নীরব করা বা ফার্মাকোলজিক্যাল M3 ইনহিবিটর ব্যবহার করা এই সমস্ত প্রভাবকে বাতিল করে দেয়, যা পরামর্শ দেয় যে DEET-প্ররোচিত অ্যাঞ্জিওজেনেসিস M3-সংবেদনশীল। এন্ডোথেলিয়াল এবং HEK কোষগুলিতে ক্যালসিয়াম সংকেত জড়িত পরীক্ষাগুলি যা M3 রিসেপ্টরগুলিকে অতিরিক্ত প্রকাশ করে, সেইসাথে বাঁধাই এবং ডকিং অধ্যয়নগুলি নির্দেশ করে যে DEET M3 রিসেপ্টরগুলির অ্যালোস্টেরিক মডুলেটর হিসাবে কাজ করে। তদুপরি, DEET ACHE কে বাধা দেয়, যার ফলে অ্যাসিটাইলকোলিনের জৈব উপলভ্যতা এবং M3 রিসেপ্টরের সাথে এর আবদ্ধতা বৃদ্ধি করে এবং অ্যালোস্টেরিক নিয়ন্ত্রণের মাধ্যমে প্রোঅ্যাঞ্জিওজেনিক প্রভাব বৃদ্ধি করে।
প্রাথমিক ইসিগুলিকে সুইস ইঁদুরের মহাধমনী থেকে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল। নিষ্কাশন পদ্ধতিটি কোবায়াশি প্রোটোকল 26 থেকে গৃহীত হয়েছিল। চতুর্থ প্যাসেজ পর্যন্ত 5% তাপ-নিষ্ক্রিয় FBS দিয়ে পরিপূরক EBM-2 মাধ্যমে মুরিন ইসিগুলিকে কালচার করা হয়েছিল।
HUVEC, U87MG, অথবা BF16F10 এর বিস্তারের উপর DEET এর দুটি ঘনত্বের প্রভাব CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026) ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, প্রতি কূপে 5.103 কোষ একটি 96-কূপ প্লেটে বীজতলা করা হয়েছিল, রাতারাতি সংযুক্ত থাকতে দেওয়া হয়েছিল এবং তারপর 24 ঘন্টার জন্য DEET দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল। বৃদ্ধি মাধ্যম অপসারণের পরে, মাইক্রোপ্লেটের প্রতিটি কূপে ডাই বাইন্ডিং দ্রবণ যোগ করুন এবং কোষগুলিকে 37 °C তাপমাত্রায় 30 মিনিটের জন্য ইনকিউবেট করুন। 485 nm এক্সাইটেশন ফিল্টার এবং 530 nm নির্গমন ফিল্টার দিয়ে সজ্জিত Mithras LB940 মাল্টিমোড মাইক্রোপ্লেট রিডার (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany) ব্যবহার করে ফ্লুরোসেন্স স্তর নির্ধারণ করা হয়েছিল।
HUVEC-কে ৯৬টি ওয়েল প্লেটে প্রতি কূপে ১০৪টি কোষের ঘনত্বে বীজতলা করা হয়েছিল। কোষগুলিকে ২৪ ঘন্টা ধরে DEET দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল। একটি কালারিমেট্রিক MTT অ্যাস (Sigma-Aldrich, M5655) ব্যবহার করে কোষের কার্যকারিতা মূল্যায়ন করা হয়েছিল। ৫৭০ nm তরঙ্গদৈর্ঘ্যের একটি মাল্টিমোড মাইক্রোপ্লেট রিডারে (Mithras LB940) অপটিক্যাল ঘনত্বের মান পাওয়া গিয়েছিল।
ইন ভিট্রো অ্যাঞ্জিওজেনেসিস অ্যাসেস ব্যবহার করে DEET-এর প্রভাবগুলি অধ্যয়ন করা হয়েছিল। 10-8 M বা 10-5 M DEET দিয়ে চিকিৎসা HUVEC-তে কৈশিক দৈর্ঘ্যের গঠন বৃদ্ধি করে (চিত্র 1a, b, সাদা বার)। নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠীর সাথে তুলনা করলে, 10-14 থেকে 10-5 M পর্যন্ত DEET ঘনত্বের চিকিৎসায় দেখা গেছে যে কৈশিক দৈর্ঘ্য 10-8 M DEET-তে একটি মালভূমিতে পৌঁছেছে (পরিপূরক চিত্র S2)। 10-8 M এবং 10-5 M ঘনত্বের পরিসরে DEET-এর সাথে চিকিৎসা করা HUVEC-এর ইন ভিট্রো প্রোঅ্যাঞ্জিওজেনিক প্রভাবে কোনও উল্লেখযোগ্য পার্থক্য পাওয়া যায়নি।
নিওভাস্কুলারাইজেশনের উপর DEET-এর প্রভাব নির্ধারণের জন্য, আমরা ইন ভিভো নিওভাস্কুলারাইজেশন স্টাডি করেছি। ১৪ দিন পর, ১০-৮ M বা ১০-৫ M DEET দিয়ে প্রিক্লচার করা এন্ডোথেলিয়াল কোষ দিয়ে ইঁদুরগুলিকে ইনজেকশন দেওয়া হলে হিমোগ্লোবিনের পরিমাণ উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পায় (চিত্র ১c, সাদা বার)।
অধিকন্তু, DEET-প্ররোচিত নিওভাস্কুলারাইজেশন U87MG জেনোগ্রাফ্ট-বহনকারী ইঁদুরগুলিতে অধ্যয়ন করা হয়েছিল যাদের প্রতিদিন (ip) DEET ইনজেকশন দেওয়া হত যা 10-5 M এর প্লাজমা ঘনত্ব প্ররোচিত করে বলে জানা যায়, যা উন্মুক্ত মানুষের ক্ষেত্রে স্বাভাবিক। 23 জনের ক্ষেত্রে। U87MG কোষ ইঁদুরে ইনজেকশন দেওয়ার 14 দিন পরে সনাক্তযোগ্য টিউমার (অর্থাৎ টিউমার >100 mm3) পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল। 28 তম দিনে, নিয়ন্ত্রণ ইঁদুরের তুলনায় DEET-চিকিৎসা করা ইঁদুরগুলিতে টিউমারের বৃদ্ধি উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছিল (চিত্র 1d, বর্গক্ষেত্র)। অধিকন্তু, টিউমারের CD31 স্টেইনিং দেখিয়েছে যে DEET উল্লেখযোগ্যভাবে কৈশিক ক্ষেত্রফল বৃদ্ধি করেছে কিন্তু মাইক্রোভেসেলের ঘনত্ব বৃদ্ধি করেনি। (চিত্র 1e-g)।
DETA-প্ররোচিত বিস্তারে মাসকারিনিক রিসেপ্টরগুলির ভূমিকা নির্ধারণের জন্য, pFHHSiD (10-7 M, একটি নির্বাচনী M3 রিসেপ্টর প্রতিপক্ষ) এর উপস্থিতিতে 10-8 M বা 10-5 M DETA ব্যবহার করা হয়েছিল। HUVEC-এর চিকিৎসা। pFHHSiD সমস্ত ঘনত্বে DETA-এর প্রসারণশীল বৈশিষ্ট্যগুলিকে সম্পূর্ণরূপে অবরুদ্ধ করে (সারণী 1)।
এই পরিস্থিতিতে, আমরা পরীক্ষা করেছিলাম যে DEET HUVEC কোষগুলিতে কৈশিকের দৈর্ঘ্য বৃদ্ধি করবে কিনা। একইভাবে, pFHHSiD DEET-প্ররোচিত কৈশিকের দৈর্ঘ্য উল্লেখযোগ্যভাবে প্রতিরোধ করে (চিত্র 1a, b, ধূসর বার)। তদুপরি, M3 siRNA এর সাথেও একই রকম পরীক্ষা করা হয়েছিল। যদিও নিয়ন্ত্রণ siRNA কৈশিক গঠনের প্রচারে কার্যকর ছিল না, M3 মাস্কারিনিক রিসেপ্টরের নীরবতা DEET-এর কৈশিকের দৈর্ঘ্য বৃদ্ধি করার ক্ষমতাকে বাতিল করে দেয় (চিত্র 1a, b, কালো বার)।
অধিকন্তু, 10-8 M অথবা 10-5 M DEET-প্ররোচিত ভাস্কুলারাইজেশন ইন ভিট্রো এবং নিওভাস্কুলারাইজেশন ইন ভিভো উভয়ই pFHHSiD দ্বারা সম্পূর্ণরূপে অবরুদ্ধ ছিল (চিত্র 1c, d, বৃত্ত)। এই ফলাফলগুলি ইঙ্গিত দেয় যে DEET নির্বাচিত M3 রিসেপ্টর প্রতিপক্ষ বা M3 siRNA-এর প্রতি সংবেদনশীল পথের মাধ্যমে অ্যাঞ্জিওজেনেসিসকে উৎসাহিত করে।
DEET-এর আণবিক লক্ষ্য হল ACHE। ডোনেপেজিলের মতো ওষুধ, যা AChE ইনহিবিটর হিসেবে কাজ করে, ইন ভিট্রো এবং মাউস হিন্ডলিম্ব ইস্কেমিয়া মডেল 14-তে EC অ্যাঞ্জিওজেনেসিসকে উদ্দীপিত করতে পারে। আমরা HUVEC-তে AChE এনজাইম কার্যকলাপের উপর DEET-এর দুটি ঘনত্বের প্রভাব পরীক্ষা করেছি। নিয়ন্ত্রণ অবস্থার তুলনায় DEET-এর কম (10-8 M) এবং উচ্চ (10-5 M) ঘনত্ব এন্ডোথেলিয়াল AChE কার্যকলাপ হ্রাস করেছে (চিত্র 2)।
DEET-এর উভয় ঘনত্ব (১০-৮ M এবং ১০-৫ M) HUVEC-তে অ্যাসিটাইলকোলিনেস্টেরেজ কার্যকলাপ হ্রাস করেছে। BW284c51 (১০-৫ M) অ্যাসিটাইলকোলিনেস্টেরেজ ইনহিবিটরগুলির জন্য নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। যানবাহন-চিকিত্সা করা কোষের তুলনায় DEET-এর দুটি ঘনত্বের সাথে চিকিত্সা করা HUVEC-তে ACHE কার্যকলাপের শতাংশ হিসাবে ফলাফল প্রকাশ করা হয়। মানগুলি ছয়টি স্বাধীন পরীক্ষার গড় ± SEM হিসাবে প্রকাশ করা হয়। *p < নিয়ন্ত্রণের তুলনায় 0.05 (ক্রুস্কাল-ওয়ালিস এবং ডান একাধিক তুলনা পরীক্ষা)।
নাইট্রিক অক্সাইড (NO) অ্যাঞ্জিওজেনিক প্রক্রিয়া 33-তে জড়িত, তাই, DEET-উদ্দীপিত HUVEC-তে NO উৎপাদন অধ্যয়ন করা হয়েছিল। নিয়ন্ত্রণ কোষের তুলনায় DEET-চিকিৎসা করা এন্ডোথেলিয়াল NO উৎপাদন বৃদ্ধি করা হয়েছিল, তবে তাৎপর্যপূর্ণ ছিল মাত্র 10-8 M (চিত্র 3c)। DEET-প্ররোচিত NO উৎপাদন নিয়ন্ত্রণকারী আণবিক পরিবর্তনগুলি নির্ধারণ করার জন্য, eNOS প্রকাশ এবং সক্রিয়করণ ওয়েস্টার্ন ব্লটিং দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। যদিও DEET চিকিৎসা eNOS প্রকাশকে পরিবর্তন করেনি, এটি eNOS ফসফোরাইলেশনের (চিত্র 3d) চিকিৎসা না করা কোষের তুলনায় এর সক্রিয়করণ স্থানে (Ser-1177) eNOS ফসফোরাইলেশন উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি করেছে (চিত্র 3d)। তদুপরি, সক্রিয়করণ স্থানে এবং প্রতিরোধমূলক স্থানে ফসফোরাইলেটেড eNOS-এর অনুপাত মোট এনজাইমের সাথে ফসফোরাইলেটেড eNOS-এর পরিমাণ স্বাভাবিক করার পরে গণনা করা হয়েছিল। চিকিত্সা না করা কোষের তুলনায় DEET-এর প্রতিটি ঘনত্বের সাথে চিকিত্সা করা HUVEC-তে এই অনুপাত উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে (চিত্র 3d)।
অবশেষে, VEGF-এর অভিব্যক্তি, যা প্রধান প্রোঅ্যাঞ্জিওজেনিক কারণগুলির মধ্যে একটি, ওয়েস্টার্ন ব্লটিং দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। DEET VEGF অভিব্যক্তি উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি করেছে, যেখানে pFHHSiD এই অভিব্যক্তিটিকে সম্পূর্ণরূপে অবরুদ্ধ করেছে।
যেহেতু DEET-এর প্রভাবগুলি M3 রিসেপ্টরের ফার্মাকোলজিকাল ব্লকেড এবং ডাউনরেগুলেশন উভয়ের প্রতিই সংবেদনশীল, তাই আমরা এই অনুমানটি পরীক্ষা করেছিলাম যে DEET ক্যালসিয়াম সিগন্যালিং উন্নত করতে পারে। আশ্চর্যজনকভাবে, DEET HUVEC (ডেটা দেখানো হয়নি) এবং HEK/M3 (চিত্র 4a, b) উভয় ঘনত্বের জন্য সাইটোপ্লাজমিক ক্যালসিয়াম বৃদ্ধি করতে ব্যর্থ হয়েছে।
পোস্টের সময়: ডিসেম্বর-৩০-২০২৪