কৃমি-নাশক ঔষধ N,N-ডাইইথাইল-m-টলুয়ামাইড (ডিইইটিM3 রিসেপ্টর AChE (অ্যাসিটাইলকোলিনেস্টারেজ)-কে বাধা দেয় বলে জানা গেছে এবং অতিরিক্ত রক্তনালী গঠনের কারণে এর সম্ভাব্য কার্সিনোজেনিক (ক্যান্সার সৃষ্টিকারী) বৈশিষ্ট্য রয়েছে। এই গবেষণাপত্রে আমরা দেখিয়েছি যে, DEET বিশেষভাবে এন্ডোথেলিয়াল কোষকে উদ্দীপিত করে যা অ্যাঞ্জিওজেনেসিসকে উৎসাহিত করে, যার ফলে টিউমারের বৃদ্ধি বাড়ে। DEET কোষীয় প্রক্রিয়াগুলোকে সক্রিয় করে যা অ্যাঞ্জিওজেনেসিসের দিকে পরিচালিত করে, যার মধ্যে রয়েছে কোষ বিভাজন, স্থানান্তর এবং আসঞ্জন। এটি এন্ডোথেলিয়াল কোষে নাইট্রিক অক্সাইড (NO) উৎপাদন বৃদ্ধি এবং VEGF এক্সপ্রেশনের সাথে সম্পর্কিত। M3-কে নিষ্ক্রিয় করা বা ফার্মাকোলজিক্যাল M3 ইনহিবিটর ব্যবহার করলে এই সমস্ত প্রভাব বিলুপ্ত হয়ে যায়, যা থেকে বোঝা যায় যে DEET-প্ররোচিত অ্যাঞ্জিওজেনেসিস M3-সংবেদনশীল। M3 রিসেপ্টর ওভারএক্সপ্রেসিং এন্ডোথেলিয়াল এবং HEK কোষে ক্যালসিয়াম সিগন্যালিং সম্পর্কিত পরীক্ষা, সেইসাথে বাইন্ডিং এবং ডকিং স্টাডিজ থেকে বোঝা যায় যে, DEET M3 রিসেপ্টরের একটি অ্যালোস্টেরিক মডিউলেটর হিসেবে কাজ করে। অধিকন্তু, DEET, AChE-কে বাধা দেয়, যার ফলে অ্যাসিটাইলকোলিনের জৈবপ্রাপ্যতা এবং M3 রিসেপ্টরের সাথে এর বাইন্ডিং বৃদ্ধি পায় এবং অ্যালোস্টেরিক নিয়ন্ত্রণের মাধ্যমে প্রোঅ্যাঞ্জিওজেনিক প্রভাব বৃদ্ধি পায়।
সুইস ইঁদুরের মহাধমনী থেকে প্রাথমিক এন্ডোথেলিয়াল কোষ (EC) পৃথক করা হয়েছিল। নিষ্কাশন পদ্ধতিটি কোবায়াশি প্রোটোকল 26 থেকে অভিযোজিত করা হয়েছিল। ইঁদুরের EC-গুলিকে চতুর্থ প্যাসেজ পর্যন্ত 5% তাপ-নিষ্ক্রিয় FBS সহ EBM-2 মাধ্যমে কালচার করা হয়েছিল।
HUVEC, U87MG, বা BF16F10 কোষের সংখ্যাবৃদ্ধির উপর DEET-এর দুটি ঘনত্বের প্রভাব CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026) ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, একটি ৯৬-ওয়েল প্লেটের প্রতিটি ওয়েলে ৫,১০³ কোষ স্থাপন করা হয়েছিল, সারারাত ধরে সংযুক্ত হতে দেওয়া হয়েছিল এবং তারপরে ২৪ ঘণ্টার জন্য DEET দিয়ে ট্রিটমেন্ট করা হয়েছিল। গ্রোথ মিডিয়াম সরানোর পর, মাইক্রোপ্লেটের প্রতিটি ওয়েলে ডাই বাইন্ডিং সলিউশন যোগ করা হয় এবং কোষগুলোকে ৩৭°C তাপমাত্রায় ৩০ মিনিটের জন্য ইনকিউবেট করা হয়। ৪৮৫ nm এক্সাইটেশন ফিল্টার এবং ৫৩০ nm এমিশন ফিল্টারযুক্ত একটি Mithras LB940 মাল্টিমোড মাইক্রোপ্লেট রিডার (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany) ব্যবহার করে ফ্লুরোসেন্সের মাত্রা নির্ধারণ করা হয়েছিল।
HUVEC কোষগুলোকে ৯৬-ওয়েল প্লেটে প্রতি ওয়েলে ১০৪টি কোষের ঘনত্বে স্থাপন করা হয়েছিল। কোষগুলোকে ২৪ ঘণ্টা ধরে DEET দিয়ে ট্রিট করা হয়েছিল। একটি কালারমেট্রিক MTT অ্যাসে (সিগমা-অলড্রিচ, M5655) ব্যবহার করে কোষের কার্যক্ষমতা মূল্যায়ন করা হয়েছিল। একটি মাল্টিমোড মাইক্রোপ্লেট রিডার (মিথ্রাস LB940)-এ ৫৭০ nm তরঙ্গদৈর্ঘ্যে অপটিক্যাল ডেনসিটি মানগুলো পাওয়া গিয়েছিল।
ইন ভিট্রো অ্যাঞ্জিওজেনেসিস অ্যাসের মাধ্যমে DEET-এর প্রভাব অধ্যয়ন করা হয়েছিল। 10⁻⁸ M বা 10⁻⁵ M DEET দিয়ে চিকিৎসায় HUVEC-গুলিতে কৈশিক নালীর দৈর্ঘ্য বৃদ্ধি পায় (চিত্র 1a, b, সাদা বার)। কন্ট্রোল গ্রুপের সাথে তুলনা করলে, 10⁻¹⁴ থেকে 10⁻⁵ M পর্যন্ত DEET ঘনত্বের চিকিৎসায় দেখা যায় যে কৈশিক নালীর দৈর্ঘ্য 10⁻⁸ M DEET-এ একটি স্থিতাবস্থায় পৌঁছায় (পরিপূরক চিত্র S2)। 10⁻⁸ M এবং 10⁻⁵ M ঘনত্বের পরিসরে DEET দিয়ে চিকিৎসাকৃত HUVEC-গুলির ইন ভিট্রো প্রোঅ্যাঞ্জিওজেনিক প্রভাবে কোনো উল্লেখযোগ্য পার্থক্য পাওয়া যায়নি।
নব্য রক্তনালী গঠনের উপর DEET-এর প্রভাব নির্ধারণ করার জন্য, আমরা ইন ভিভো নব্য রক্তনালী গঠন সংক্রান্ত গবেষণা পরিচালনা করেছি। ১৪ দিন পর, 10⁻⁸ M বা 10⁻⁵ M DEET দিয়ে প্রিকালচার করা এন্ডোথেলিয়াল কোষ ইনজেকশন দেওয়া ইঁদুরগুলির হিমোগ্লোবিনের পরিমাণে উল্লেখযোগ্য বৃদ্ধি দেখা গেছে (চিত্র ১গ, সাদা বার)।
এছাড়াও, U87MG জেনোগ্রাফ্ট-বহনকারী ইঁদুরের উপর DEET-প্ররোচিত নতুন রক্তনালীর গঠন নিয়ে গবেষণা করা হয়েছিল। এই ইঁদুরগুলোকে প্রতিদিন (ip) এমন মাত্রায় DEET ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিল যা 10-5 M প্লাজমা ঘনত্ব তৈরি করে, যা DEET-এর সংস্পর্শে আসা মানুষের ক্ষেত্রে স্বাভাবিক। ইঁদুরের মধ্যে U87MG কোষ ইনজেকশন দেওয়ার ১৪ দিন পর শনাক্তযোগ্য টিউমার (অর্থাৎ >100 mm³ আকারের টিউমার) দেখা গিয়েছিল। ২৮তম দিনে, নিয়ন্ত্রণাধীন ইঁদুরের তুলনায় DEET-চিকিৎসাপ্রাপ্ত ইঁদুরের টিউমারের বৃদ্ধি উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি ছিল (চিত্র ১d, বর্গক্ষেত্র)। এছাড়াও, টিউমারের CD31 স্টেইনিং থেকে দেখা যায় যে DEET কৈশিক নালীর ক্ষেত্রফল উল্লেখযোগ্যভাবে বাড়িয়েছে, কিন্তু ক্ষুদ্র রক্তনালীর ঘনত্ব বাড়ায়নি (চিত্র ১e–g)।
DETA-প্ররোচিত কোষ বৃদ্ধিতে মাসকারিনিক রিসেপ্টরের ভূমিকা নির্ধারণ করার জন্য, pFHHSiD (10-7 M, একটি নির্বাচিত M3 রিসেপ্টর অ্যান্টাগনিস্ট)-এর উপস্থিতিতে 10-8 M বা 10-5 M DETA ব্যবহার করা হয়েছিল। pFHHSiD সমস্ত ঘনত্বে DETA-এর কোষ বৃদ্ধি সংক্রান্ত বৈশিষ্ট্য সম্পূর্ণরূপে অবরুদ্ধ করে (সারণি 1)।
এই পরিস্থিতিতে, আমরা আরও পরীক্ষা করে দেখেছি যে DEET, HUVEC কোষে কৈশিক নালীর দৈর্ঘ্য বৃদ্ধি করে কিনা। একইভাবে, pFHHSiD উল্লেখযোগ্যভাবে DEET-প্ররোচিত কৈশিক নালীর দৈর্ঘ্য বৃদ্ধি প্রতিরোধ করেছে (চিত্র ১ক, খ, ধূসর বার)। অধিকন্তু, M3 siRNA ব্যবহার করে অনুরূপ পরীক্ষা করা হয়েছিল। যদিও নিয়ন্ত্রক siRNA কৈশিক নালী গঠনে কার্যকর ছিল না, M3 মাসকারিনিক রিসেপ্টরকে নিষ্ক্রিয় করার ফলে কৈশিক নালীর দৈর্ঘ্য বৃদ্ধি করার ক্ষেত্রে DEET-এর ক্ষমতা বিলুপ্ত হয়ে যায় (চিত্র ১ক, খ, কালো বার)।
তদুপরি, ইন ভিট্রোতে 10⁻⁸ M বা 10⁻⁵ M DEET-প্ররোচিত রক্তনালী গঠন এবং ইন ভিভোতে নতুন রক্তনালী গঠন উভয়ই pFHHSiD দ্বারা সম্পূর্ণরূপে অবরুদ্ধ হয়েছিল (চিত্র ১গ, ঘ, বৃত্ত)। এই ফলাফলগুলি ইঙ্গিত দেয় যে DEET এমন একটি পথের মাধ্যমে রক্তনালী গঠনকে উৎসাহিত করে যা নির্বাচিত M3 রিসেপ্টর অ্যান্টাগনিস্ট বা M3 siRNA-এর প্রতি সংবেদনশীল।
AChE হলো DEET-এর আণবিক লক্ষ্যবস্তু। ডনেপেজিলের মতো ওষুধ, যা AChE ইনহিবিটর হিসেবে কাজ করে, ইন ভিট্রো এবং ইঁদুরের পশ্চাৎপদের ইস্কেমিয়া মডেলে EC অ্যাঞ্জিওজেনেসিসকে উদ্দীপিত করতে পারে¹⁴। আমরা HUVEC-এ AChE এনজাইমের কার্যকলাপের উপর DEET-এর দুটি ঘনত্বের প্রভাব পরীক্ষা করেছি। নিয়ন্ত্রিত অবস্থার তুলনায় DEET-এর কম (10⁻⁸ M) এবং উচ্চ (10⁻⁵ M) ঘনত্ব এন্ডোথেলিয়াল AChE কার্যকলাপ হ্রাস করেছে (চিত্র ২)।
DEET-এর উভয় ঘনত্ব (10⁻⁸ M এবং 10⁻⁵ M) HUVEC-এর উপর অ্যাসিটাইলকোলিনেস্টারেজ কার্যকলাপ হ্রাস করেছে। অ্যাসিটাইলকোলিনেস্টারেজ ইনহিবিটরের জন্য কন্ট্রোল হিসেবে BW284c51 (10⁻⁵ M) ব্যবহার করা হয়েছিল। ফলাফলগুলি ভেহিকেল-ট্রিটেড কোষের তুলনায় DEET-এর দুটি ঘনত্ব দ্বারা ট্রিটেড HUVEC-এর উপর AChE কার্যকলাপের শতাংশ হিসাবে প্রকাশ করা হয়েছে। মানগুলি ছয়টি স্বাধীন পরীক্ষার গড় ± SEM হিসাবে প্রকাশ করা হয়েছে। *p < 0.05 কন্ট্রোলের তুলনায় (ক্রুসকাল-ওয়ালিস এবং ডান মাল্টিপল কম্প্যারিসন টেস্ট)।
নাইট্রিক অক্সাইড (NO) অ্যাঞ্জিওজেনিক প্রক্রিয়ার সাথে জড়িত, তাই DEET-উদ্দীপিত HUVEC-গুলিতে NO উৎপাদন নিয়ে গবেষণা করা হয়েছিল। কন্ট্রোল কোষের তুলনায় DEET-চিকিৎসিত এন্ডোথেলিয়াল NO উৎপাদন বৃদ্ধি পেয়েছিল, কিন্তু এটি শুধুমাত্র 10-8 M ডোজে তাৎপর্যপূর্ণ পর্যায়ে পৌঁছেছিল (চিত্র 3c)। DEET-প্ররোচিত NO উৎপাদন নিয়ন্ত্রণকারী আণবিক পরিবর্তনগুলি নির্ধারণ করার জন্য, ওয়েস্টার্ন ব্লটিং-এর মাধ্যমে eNOS এক্সপ্রেশন এবং অ্যাক্টিভেশন বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। যদিও DEET চিকিৎসা eNOS এক্সপ্রেশন পরিবর্তন করেনি, তবে এটি eNOS ফসফোরাইলেশনের ক্ষেত্রে অপরিশোধিত কোষের তুলনায় এর অ্যাক্টিভেটিং সাইটে (Ser-1177) ফসফোরাইলেশন উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি করেছে এবং ইনহিবিটরি সাইটে (Thr-495) হ্রাস করেছে (চিত্র 3d)। অধিকন্তু, ফসফোরাইলেটেড eNOS-এর পরিমাণকে এনজাইমের মোট পরিমাণের সাথে স্বাভাবিক করার পর অ্যাক্টিভেশন সাইট এবং ইনহিবিটরি সাইটে ফসফোরাইলেটেড eNOS-এর অনুপাত গণনা করা হয়েছিল। অপরিশোধিত কোষের তুলনায় DEET-এর প্রতিটি ঘনত্বে চিকিৎসা করা HUVEC-গুলিতে এই অনুপাত উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছিল (চিত্র 3d)।
অবশেষে, প্রধান প্রোঅ্যাঞ্জিওজেনিক ফ্যাক্টরগুলোর অন্যতম VEGF-এর এক্সপ্রেশন ওয়েস্টার্ন ব্লটিং-এর মাধ্যমে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। DEET উল্লেখযোগ্যভাবে VEGF এক্সপ্রেশন বৃদ্ধি করেছিল, অপরদিকে pFHHSiD এই এক্সপ্রেশনকে সম্পূর্ণরূপে অবরুদ্ধ করেছিল।
যেহেতু DEET-এর প্রভাব M3 রিসেপ্টরের ফার্মাকোলজিক্যাল ব্লকেড এবং ডাউনরেগুলেশন উভয়ের প্রতিই সংবেদনশীল, তাই আমরা এই অনুমানটি পরীক্ষা করে দেখেছি যে DEET ক্যালসিয়াম সিগন্যালিং বাড়াতে পারে। আশ্চর্যজনকভাবে, ব্যবহৃত উভয় ঘনত্বের ক্ষেত্রেই DEET, HUVEC (তথ্য দেখানো হয়নি) এবং HEK/M3 (চিত্র ৪ক, খ)-এর সাইটোপ্লাজমিক ক্যালসিয়াম বাড়াতে ব্যর্থ হয়েছে।
পোস্ট করার সময়: ৩০-১২-২০২৪
