বিশ্বব্যাপী খাদ্য ঘাটতি মোকাবেলা এবং বাহক-বাহিত মানব রোগ প্রতিরোধের ক্ষেত্রে কীটনাশক একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে। তবে, কীটনাশক প্রতিরোধের ক্রমবর্ধমান সমস্যার কারণে এমন নতুন যৌগ আবিষ্কারের জরুরি প্রয়োজন দেখা দিয়েছে যা অব্যবহৃত লক্ষ্যবস্তুগুলোকে নিশানা করতে পারে। পোকামাকড়ের ট্রানজিয়েন্ট রিসেপ্টর পটেনশিয়াল (TRPV) চ্যানেল—ন্যানঝং (Nan) এবং নিষ্ক্রিয় (Iav)—হেটেরোলোগাস চ্যানেল (Nan-Iav) গঠন করতে পারে এবং পোকামাকড়ের যান্ত্রিক-সংবেদী অঙ্গে অবস্থান করতে পারে, যা তাদের ভূ-অভিমুখিতা, শ্রবণ এবং দেহ-সংবেদী অঙ্গের সঞ্চালনে মধ্যস্থতা করে। কিছু কীটনাশক, যেমন অ্যাফিডোপাইরোলিডোন (AP), অজানা প্রক্রিয়ার মাধ্যমে Nan-Iav-কে নিশানা করে। AP ছিদ্রকারী-চোষক পোকামাকড়ের (হেমিপ্টেরান) বিরুদ্ধে কার্যকর, যা ফিলামেন্টের কার্যকারিতা ব্যাহত করে তাদের খাদ্যগ্রহণ প্রতিরোধ করে। AP শুধুমাত্র Nan-এর সাথে আবদ্ধ হতে পারে, কিন্তু শুধুমাত্র Nan-Iav-ই এন্ডোজেনাস নিকোটিনামাইড (NAM) সহ অ্যাগোনিস্টের সাথে মিথস্ক্রিয়া করতে পারে, যার ফলে চ্যানেল কার্যকলাপ প্রদর্শন করে। কীটনাশকের লক্ষ্যবস্তু হিসেবে ন্যান-আইএভি-এর সম্ভাবনা থাকা সত্ত্বেও, এর চ্যানেল গঠন, নিয়ন্ত্রক বন্ধন স্থান এবং Ca2+-নির্ভর নিয়ন্ত্রণ সম্পর্কে খুব কমই জানা যায়, যা আরও কীটনাশক উন্নয়নে বাধা সৃষ্টি করে। এই গবেষণায়, ক্যালমোডুলিন-লিগ্যান্ড-মুক্ত অবস্থায় এবং অ্যাঙ্কিরিন রিপিট সাইটোপ্লাজমিক ডোমেন (ARD)-এর সীমানায় AP ও NAM-সহ হেমিপ্টেরা পতঙ্গের ন্যান-আইএভি-এর গঠন নির্ধারণ করতে ক্রায়ো-ইলেকট্রন মাইক্রোস্কোপি ব্যবহার করা হয়েছে। আশ্চর্যজনকভাবে, আমরা দেখতে পাই যে ন্যান প্রোটিন নিজেই একটি পেন্টামার গঠন করতে পারে, যা AP-মধ্যস্থ ARD মিথস্ক্রিয়ার মাধ্যমে স্থিতিশীল হয়। এই গবেষণাটি কীটনাশক ও অ্যাগোনিস্ট এবং ন্যান-আইএভি-এর মধ্যে আণবিক মিথস্ক্রিয়া উন্মোচন করে, চ্যানেলের কার্যকারিতা ও গঠনে ARD-এর গুরুত্ব তুলে ধরে এবং Ca2+ নিয়ন্ত্রণের প্রক্রিয়া অন্বেষণ করে।
ক্রমবর্ধমান তীব্র বৈশ্বিক জলবায়ু পরিবর্তনের প্রেক্ষাপটে, বিশ্বব্যাপী খাদ্য নিরাপত্তার অবনতি একবিংশ শতাব্দীর অন্যতম প্রধান চ্যালেঞ্জ, যার সুদূরপ্রসারী পরিণতি সমাজে ছড়িয়ে পড়ছে।১,২বিশ্ব স্বাস্থ্য সংস্থার ‘বিশ্বে খাদ্য নিরাপত্তা ও পুষ্টির অবস্থা ২০২৩’ (SOFI) প্রতিবেদন অনুযায়ী, বিশ্বজুড়ে প্রায় ২.৩৩ বিলিয়ন মানুষ মাঝারি থেকে গুরুতর খাদ্য নিরাপত্তাহীনতায় ভুগছে, যা একটি দীর্ঘস্থায়ী সমস্যা।৩,৪দুর্ভাগ্যবশত, কীটপতঙ্গ ও রোগজীবাণুর কারণে প্রতি বছর ফসলের আনুমানিক ২০ থেকে ৩০ শতাংশ বা তারও বেশি উৎপাদন নষ্ট হয় এবং আশঙ্কা করা হচ্ছে যে বিশ্ব উষ্ণায়ন কীটপতঙ্গের প্রতিরোধ ক্ষমতা ও ফসলের ঝুঁকি আরও বাড়িয়ে তুলবে।৪,৫,৬,৭,৮ফসলকে কীটপতঙ্গের হাত থেকে রক্ষা করতে এবং বাহক-বাহিত রোগজীবাণুর বিস্তার কমাতে তো বটেই, সেই সাথে ডেঙ্গু জ্বর, ম্যালেরিয়া এবং চাগাস রোগের মতো বাহক-বাহিত মানব রোগ মোকাবেলার জন্যও কীটনাশকের উন্নয়ন অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ, কারণ এই রোগগুলো কীটনাশকের বিরুদ্ধে ক্রমশ প্রতিরোধী হয়ে উঠছে।৫,৯,১০,১১
নিউরোটক্সিক কীটনাশকের প্রধান লক্ষ্যবস্তুগুলোর মধ্যে, হেটেরোটেট্রামেরিক TRPV চ্যানেল নানচুং (Nan)-ইনঅ্যাক্টিভ (Iav) এমন এক শ্রেণীর কীটনাশক লক্ষ্যবস্তুর প্রতিনিধিত্ব করে যা কেবল গত দশকেই আবিষ্কৃত হয়েছে, যার মধ্যে ইমিডাক্লোপ্রিড এবং পাইরাক্লোস্ট্রোবিনের মতো বাণিজ্যিকভাবে উপলব্ধ কীটনাশকও অন্তর্ভুক্ত।১২,১৩,১৪অর্ধ-সংশ্লেষিত কীটনাশক অ্যাফিডোপাইরোলিফেন (AP) হলো সম্প্রতি উদ্ভাবিত ও বাণিজ্যিকভাবে বাজারজাতকৃত একটি পণ্য, যার প্রধান উপাদান হলো সক্রিয় কীটনাশক ইনস্ক্যালিস® (Inscalis®), যা সাবন্যানোমোলার সক্রিয়তা স্তরে AP-কে আবদ্ধ করে।15পরাগায়নকারী, উপকারী পোকামাকড় এবং অন্যান্য অ-লক্ষ্য জীবের ক্ষেত্রে এপি-র তীব্র বিষক্রিয়া কম, এবং লেবেলের নির্দেশাবলী অনুযায়ী ব্যবহার করা হলে এটি অন্যান্য কীটনাশকের বিরুদ্ধে প্রতিরোধের চাপ কমাতে পারে।১৬, ১৭, ১৮Nan এবং Iav বিভিন্ন পতঙ্গ প্রজাতির মধ্যে ব্যাপকভাবে বিস্তৃত, কেবলমাত্র অ্যান্টেনা এবং অঙ্গপ্রত্যঙ্গের কর্ডাল স্ট্রেচ রিসেপ্টর নিউরনে সহ-প্রকাশিত হয় এবং শ্রবণ, মাধ্যাকর্ষণ উপলব্ধি এবং প্রোপ্রিওসেপশনের জন্য অপরিহার্য।১৩, ১৬, ১৯, ২০, ২১, ২২AP, ইমিডাক্লোপ্রিড এবং পাইরাক্লোস্ট্রোবিন একটি অনন্য প্রক্রিয়ার মাধ্যমে Nan-Iav কমপ্লেক্সকে উদ্দীপিত করে, যা পরিণামে প্রোপ্রিওসেপ্টিভ সংকেত সঞ্চালনকে বাধা দেয়।১৩, ১৬, ২৩জাবপোকা এবং সাদা মাছির মতো ছিদ্র করে রস শোষণকারী পতঙ্গদের (হেমিপ্টেরান) ক্ষেত্রে, দেহের অবস্থান ও সংবেদনের অভাব তাদের খাদ্য গ্রহণের ক্ষমতা হ্রাস করে, যা শেষ পর্যন্ত তাদের মৃত্যুর কারণ হয়।১৩,২৪মজার ব্যাপার হলো, AP-এর Nan-Iav জটিল যৌগটির প্রতি উচ্চ আকর্ষণ এবং শুধুমাত্র Nan-এর প্রতি কম আকর্ষণ রয়েছে। Nan-Iav-এর সাথে AP-এর সংযোগ একটি বৈদ্যুতিক প্রবাহ সৃষ্টি করে, কিন্তু শুধুমাত্র Nan-এর সাথে সংযোগ চ্যানেলের কার্যকারিতা উদ্দীপিত করে না। Iav নিজে AP-এর সাথে একেবারেই সংযুক্ত হয় না।16এটি ইঙ্গিত দেয় যে Nan এবং Iav সংযুক্ত হয়ে বিভিন্ন Nan-Iav চ্যানেল কমপ্লেক্স গঠন করতে পারে (যেমন, ভিন্ন স্টোইকিওমেট্রিক অনুপাতে বা একই স্টোইকিওমেট্রিক অনুপাতের মধ্যে ভিন্ন বিন্যাসে) অথবা AP একাধিক স্থানে সংযুক্ত হতে পারে। অধিকন্তু, প্রাকৃতিক অ্যাগোনিস্ট নিকোটিনামাইড (NAM) মাইক্রোমোলার অ্যাফিনিটিতে ড্রসোফিলা Nan-Iav-এর সাথে সংযুক্ত হয় এবং ইন ভিট্রোতে এফিডের (AP) অনুরূপ প্রভাব প্রদর্শন করে।১৬,২৫এবং জাবপোকার প্রজনন ও খাদ্যগ্রহণ ব্যাহত করে, যার ফলে অবশেষে তাদের মৃত্যু ঘটে।২৫,২৬এই তথ্যগুলো অনেক প্রশ্ন উত্থাপন করে। উদাহরণস্বরূপ, এটা এখনও অস্পষ্ট যে ন্যান-আইএভি হেটেরোডাইমার কীভাবে গঠিত হয়, ক্ষুদ্র অণুগুলোকে নিয়ন্ত্রণ করতে কোন বাইন্ডিং সাইটগুলো ব্যবহৃত হয়, এবং এই ক্ষুদ্র অণুগুলো কীভাবে প্রোপ্রিওসেপশন দমন করার মাধ্যমে চ্যানেলের কার্যকারিতা নিয়ন্ত্রণ করে। অধিকন্তু, কেন ন্যান নিজে নিষ্ক্রিয় এবং এপি-এর প্রতি এর আকর্ষণ কম, অথচ ন্যান-আইএভি হেটেরোডাইমার সক্রিয় এবং উচ্চতর আকর্ষণের সাথে এপি-কে আবদ্ধ করে—এই কারণগুলোও অস্পষ্ট রয়ে গেছে। পরিশেষে, ন্যান-আইএভি-এর কার্যকারিতার Ca2+-নির্ভর নিয়ন্ত্রণ এবং এটি কীভাবে নিউরোনাল সিগন্যালিং প্রক্রিয়ার সাথে সমন্বিত হয়, সে সম্পর্কে খুব কমই জানা যায়।১৩,২১
এই গবেষণায়, ক্রায়ো-ইলেকট্রন মাইক্রোস্কোপি, ইলেক্ট্রোফিজিওলজি এবং রেডিওলিগ্যান্ড বাইন্ডিং কৌশলগুলোর সমন্বয়ে, আমরা Nan-Iav-এর গঠন এবং ক্ষুদ্র অণু নিয়ন্ত্রকদের সাথে এর সংযুক্তির প্রক্রিয়াটি ব্যাখ্যা করেছি। অধিকন্তু, আমরা Iav এবং AP-দ্বারা স্থিতিশীলকৃত Nan পেন্টামারের সাথে গঠনগতভাবে আবদ্ধ ক্যালমোডুলিন (CaM) শনাক্ত করেছি। এই ফলাফলগুলো চ্যানেলে ক্যালসিয়াম আয়নের নিয়ন্ত্রণ, চ্যানেল গঠন এবং লিগ্যান্ড বাইন্ডিং অ্যাফিনিটি নির্ধারণকারী উপাদানগুলো সম্পর্কে গুরুত্বপূর্ণ অন্তর্দৃষ্টি প্রদান করে। আরও গুরুত্বপূর্ণভাবে, আমরা নিশ্চিত করেছি যে এই প্রক্রিয়াগুলোতে ARD একটি কেন্দ্রীয় ভূমিকা পালন করে। প্রাসঙ্গিক কৃষি কীটনাশকের সাথে আবদ্ধ সম্পূর্ণ পতঙ্গ চ্যানেলগুলোর উপর আমাদের গবেষণা।২৭, ২৮, ২৯এটি কীটনাশক শিল্পের বিকাশের সম্ভাবনা উন্মোচন করে, কীটনাশকের কার্যকারিতা ও সুনির্দিষ্টতা উন্নত করে এবং বৈশ্বিক খাদ্য নিরাপত্তা ও বাহক-বাহিত রোগের বিস্তার মোকাবেলায় অন্যান্য প্রজাতির ক্ষেত্রে টিআরপিভি-লক্ষ্যযুক্ত যৌগসমূহের প্রয়োগ সক্ষম করে।
আমরা আরও দেখেছি যে ন্যান-আইএভি (Nan-Iav) Ca2+ দ্বারা নিয়ন্ত্রিত হয়, এবং এই নিয়ন্ত্রণের প্রক্রিয়াটি গঠনগতভাবে আবদ্ধ CaM দ্বারা মধ্যস্থতা লাভ করে। গুরুত্বপূর্ণভাবে, CaM দ্বারা ন্যাভ-এর এই Ca2+-নির্ভর নিয়ন্ত্রণ অন্যান্য আয়ন চ্যানেলের (যেমন, ভোল্টেজ-গেটেড Na+ চ্যানেল এবং TRPV5/6 চ্যানেল) নিয়ন্ত্রণ প্রক্রিয়া থেকে উল্লেখযোগ্যভাবে ভিন্ন।৫২, ৫৩, ৫৪, ৫৫, ৫৬, ৫৭Nav1.2 চ্যানেলে, CaM-এর C-টার্মিনাল ডোমেইনটি CTD-এর C-টার্মিনাল ডোমেইনের (CTD) সাথে সর্পিলভাবে যুক্ত থাকে, এবং Ca2+ এর প্রভাবে এর N-টার্মিনাল ডোমেইনটি CTD-এর দূরবর্তী অংশের সাথে আবদ্ধ হয়।56TRPV5/6 চ্যানেলে, CaM-এর C-টার্মিনাল ডোমেইন CTH-এর সাথে আবদ্ধ হয় এবং Ca2+ এর N-টার্মিনাল ডোমেইনকে ছিদ্রের মধ্যে ঊর্ধ্বমুখী প্রসারণে প্ররোচিত করে, যার ফলে ক্যাটায়ন ভেদ্যতা অবরুদ্ধ হয়।৫৩,৫৪আমরা Nan-Iav-CaM-এর Ca2+-নিয়ন্ত্রিত কার্যকারিতার জন্য একটি মডেল প্রস্তাব করছি (চিত্র ৪h)। এই মডেলে, CaM-এর N-টার্মিনাল ডোমেইনটি Iav-এর C-টার্মিনাল ডোমেইনের (CTH) সাথে অবিচ্ছিন্নভাবে আবদ্ধ থাকে। বিশ্রাম অবস্থায় (কম [Ca2+] ঘনত্ব), CaM-এর C-টার্মিনাল ডোমেইনটি Nan-এর সাথে মিথস্ক্রিয়া করে, ARD-এর গঠনকে স্থিতিশীল করে এবং এর ফলে চ্যানেল খোলাকে ত্বরান্বিত করে। চ্যানেলের সাথে কোনো অ্যাগোনিস্ট/কীটনাশকের সংযুক্তি ছিদ্রপথ খুলে দেয়, যার ফলে Ca2+ অন্তঃপ্রবাহ ঘটে। এরপর Ca2+, CaM-এর সাথে আবদ্ধ হয়, যা Nan-এর ARD থেকে C-টার্মিনাল ডোমেইনের বিচ্ছেদ ঘটায়। যেহেতু CaM-এর সংযুক্তিকে বাধা দিলে Ca2+-এর প্রতিরোধমূলক প্রভাব কার্যত বিলুপ্ত হয়ে যায়, তাই এই বিচ্ছেদ ARD-এর সচলতাকে নিয়ন্ত্রণ করে, যার ফলে Ca2+-নির্ভর প্রতিরোধ বা সংবেদনশীলতা হ্রাস ঘটে। ক্যালসিয়াম আয়ন নিঃসরণের পর চ্যানেল কারেন্টের দ্রুত পুনরুদ্ধার (চিত্র 4g) ইঙ্গিত দেয় যে এই প্রক্রিয়াটি Ca2+-মধ্যস্থ স্নায়বিক সংকেতের প্রতি দ্রুত প্রতিক্রিয়া সহজতর করে। অধিকন্তু, Iav-এর C-টার্মিনাল অঞ্চল, যা সম্পর্কে এখনও ভালোভাবে জানা যায়নি, চ্যানেল টার্গেটিং এবং কারেন্ট নিয়ন্ত্রণে অন্যান্য ভূমিকা পালন করে বলে জানা গেছে।21
অবশেষে, আমাদের গবেষণাটি কৃষিগতভাবে গুরুত্বপূর্ণ একটি কীটনাশক-কীটনাশক টিআরপি চ্যানেল কমপ্লেক্সের উচ্চ-রেজোলিউশন কাঠামো উপস্থাপন করে—যা পূর্বে আমাদের কাছে অজানা ছিল। উল্লেখযোগ্যভাবে, আমরা কীটপতঙ্গের কোষের পরিবর্তে মানব কোষে (HEK293S GnTi–) এই কীটপতঙ্গ চ্যানেলের গঠন ও কার্যকারিতা নিরূপণ করেছি। ক্রমবর্ধমান কীটনাশক প্রতিরোধ ক্ষমতা এবং খাদ্য নিরাপত্তা ও রোগজীবাণুর উপর চলমান চাপের মুখে, আমাদের এই কাজটি এমন গুরুত্বপূর্ণ তথ্য সরবরাহ করে যা মানব স্বাস্থ্য এবং বৈশ্বিক খাদ্য নিরাপত্তার স্বার্থে নতুন কীটনাশকের বিকাশে সহায়তা করবে। গবেষণায় দেখা গেছে যে, এপি-র মতো কীটনাশক লেবেলের নির্দেশাবলী অনুযায়ী ব্যবহার করা হলে কিছু কীটপতঙ্গের বিরুদ্ধে কার্যকর এবং উপকারী পরাগায়নকারীদের জন্য এদের তীব্র বিষক্রিয়া কম, যা এদের পরিবেশগত নিরাপত্তা প্রমাণ করে।১৩,১৬এছাড়াও, মশার উপর কিছু AP ডেরিভেটিভের পরীক্ষায় দেখা গেছে যে তারা অবশেষে উড়ার ক্ষমতা হারিয়ে ফেলে। এই মডুলেটিং যৌগগুলি কীভাবে Nan-Iav-এর সাথে আবদ্ধ হয় তা বুঝতে পারলে বিদ্যমান যৌগগুলির পরিবর্তন অথবা আরও কার্যকর নতুন যৌগ তৈরি করা সহজ হবে।সুনির্দিষ্টকীটপতঙ্গ নিয়ন্ত্রণ। আমাদের গবেষণা দেখায় যে Nan-Iav ARD ইন্টারফেসটি কেবল অন্তঃসৃষ্ট যৌগ, কীটনাশক এবং Ca2+-CaM-এর কার্যকলাপ নিয়ন্ত্রণের জন্যই নয়, বরং চ্যানেল অ্যাসেম্বলির জন্যও অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ। আমরা মনে করি যে ক্ষুদ্র অণু দ্বারা হেটেরোডাইমার অ্যাসেম্বলি ব্যাহত করা আয়ন চ্যানেল ইনহিবিটর তৈরির জন্য একটি অনন্য এবং সম্ভাবনাময় পন্থা হতে পারে।
আটটি অর্থোলোগাস জিনের মধ্যে, ডিটারজেন্টে চমৎকার স্থিতিশীলতা প্রদর্শনকারী বাদামী গুবরে পোকার (Halyomorpha halys) Nanchung এবং Inactive পূর্ণ-দৈর্ঘ্যের জিনগুলো নির্বাচন করা হয়েছিল। সংশ্লেষিত জিনগুলোকে মানুষের মধ্যে প্রকাশের জন্য কোডন-অপ্টিমাইজ করা হয়েছিল এবং XhoI ও EcoRI রেস্ট্রিকশন সাইট ব্যবহার করে pBacMam pCMV-DEST ভেক্টরে (Life Technologies) ক্লোন করা হয়েছিল। এটি নিশ্চিত করেছিল যে ক্লোনগুলো C-টার্মিনাল GFP-FLAG-10xHis এবং mCherry-FLAG-10xHis ট্যাগগুলোর সাথে ইন-ফ্রেম ছিল, যেগুলো HRC-3C প্রোটিয়েজ (PPX) দ্বারা খণ্ডিত হয়, যা স্বাধীনভাবে কাজ করার সুযোগ দেয়।অভিব্যক্তিpBacMam ভেক্টরে Nanchung এবং Inactive ক্লোন করার জন্য ব্যবহৃত প্রাইমারগুলো নিম্নরূপ ছিল:
একটি K3 ক্যামেরা এবং একটি Gatan BioQuantum এনার্জি ফিল্টারযুক্ত Titan Krios G2 ট্রান্সমিশন ইলেকট্রন মাইক্রোস্কোপ (FEI) ব্যবহার করে স্বতন্ত্র কণাগুলির আণুবীক্ষণিক চিত্র সংগ্রহ করা হয়েছিল। মাইক্রোস্কোপটি 300 keV-তে চালিত হয়েছিল, যেখানে এনার্জি সেটিং ছিল 20 eV, নমুনার পিক্সেল সাইজ ছিল 1.08 Å/pixel (নামমাত্র বিবর্ধন 81,000x), এবং ডিফোকাস গ্রেডিয়েন্ট ছিল -0.8 থেকে -2.2 μm পর্যন্ত। একটি Latitude S মাইক্রোস্কোপ (Gatan) ব্যবহার করে প্রতি সেকেন্ডে 40 ফ্রেমে ভিডিও রেকর্ডিং করা হয়েছিল, যেখানে নামমাত্র ডোজ রেট ছিল 25 e–px−1 s−1, এক্সপোজার সময় ছিল 2.4 সেকেন্ড এবং মোট ডোজ ছিল প্রায় 60 e–Å−2।
RELION 4.061-এ MotionCor2 ব্যবহার করে ফিল্মের উপর বিম-জনিত গতি সংশোধন এবং ডোজ ওয়েটিং করা হয়েছিল। প্যাচ-ভিত্তিক CTF অনুমান পদ্ধতি৬২ ব্যবহার করে cryoSPARC-এ কনট্রাস্ট ট্রান্সফার ফাংশন (CTF) প্যারামিটার অনুমান করা হয়েছিল। ≥৪ Å CTF ফিটিং রেজোলিউশনযুক্ত ফটোমাইক্রোগ্রাফগুলি পরবর্তী বিশ্লেষণ থেকে বাদ দেওয়া হয়েছিল। সাধারণত, cryoSPARC-এ পয়েন্ট নির্বাচনের জন্য ৫০০-১০০০ ফটোমাইক্রোগ্রাফের একটি উপসেট ব্যবহার করা হয়েছিল, এরপর টেমপ্লেট-ভিত্তিক কণা নির্বাচনের জন্য একটি স্পষ্ট রেফারেন্স চিত্র পেতে ফিল্টারিং-এর পরে বেশ কয়েক রাউন্ড ২ডি ক্লাসিফিকেশন করা হয়েছিল। তারপর ৬৪-পিক্সেল বাউন্ডিং বক্স এবং ৪-ফোল্ড বিনিং ব্যবহার করে কণাগুলি নিষ্কাশন করা হয়েছিল। অবাঞ্ছিত কণার বিভাগগুলি অপসারণ করার জন্য বেশ কয়েক রাউন্ড ২ডি ক্লাসিফিকেশন করা হয়েছিল। প্রাথমিক ৩ডি মডেলটি অ্যাব ইনিশিও রিকনস্ট্রাকশন ব্যবহার করে পুনর্গঠন করা হয়েছিল এবং cryoSPARC-এ ননইউনিফর্ম রিফাইমেন্ট ব্যবহার করে পরিমার্জন করা হয়েছিল। ARD হেটেরোজেনিটির উপর ভিত্তি করে cryoSPARC বা RELION-এ ৩ডি ক্লাসিফিকেশন করা হয়েছিল। মেমব্রেন ডোমেইনগুলির কোনও উল্লেখযোগ্য হেটেরোজেনিটি পরিলক্ষিত হয়নি। C1 এবং C2 পদ্ধতি ব্যবহার করে কণাগুলোকে পরিমার্জন করা হয়েছিল; উচ্চতর C2 রেজোলিউশনযুক্ত কণাগুলোকে C2-এর সাপেক্ষে প্রতিসম হিসেবে বিবেচনা করে বেসিয়ান পরিমার্জনের জন্য RELION-এ আমদানি করা হয়েছিল। এরপর চূড়ান্ত অসম এবং স্থানীয় পরিমার্জনের জন্য কণাগুলোকে আবার cryoSPARC-এ স্থানান্তর করা হয়েছিল। চূড়ান্ত রেজোলিউশন এবং কণার সংখ্যা সারণি ১-এ দেখানো হয়েছে।
Nan+AP পেন্টামার প্রক্রিয়াকরণের সময়, আমরা মেমব্রেন ডোমেনের (বিশেষ করে পোর অঞ্চলের) রেজোলিউশন উন্নত করার জন্য সিগন্যাল সাবট্র্যাকশন এবং TMD মাস্কিং-এর মতো বিভিন্ন পদ্ধতি অন্বেষণ করেছি। তবে, পোর অঞ্চলের সম্ভাব্য চরম বিশৃঙ্খলা এবং TMD-এর সামগ্রিক ভিন্নধর্মিতার কারণে এই প্রচেষ্টাগুলো ব্যর্থ হয়েছিল। চূড়ান্ত রেজোলিউশন গণনা করা হয়েছিল cryoSPARC-এর ননইউনিফর্ম প্রসেসিং পদ্ধতি দ্বারা স্বয়ংক্রিয়ভাবে তৈরি একটি মাস্ক ব্যবহার করে, যা প্রধানত ARD অঞ্চলকে লক্ষ্য করে তৈরি। এর ফলে মেমব্রেন ডোমেনের (বিশেষ করে VSLD অঞ্চলের) তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে উচ্চতর রেজোলিউশন অর্জিত হয়েছিল।
নানচুং এবং ইনঅ্যাক্টিভ বাগ-এর অ্যাপো ফর্মের প্রাথমিক ডি নভো মডেলগুলো প্রথমে Coot63 ব্যবহার করে তৈরি করা হয়েছিল, এবং কম-কনফিডেন্স অঞ্চলগুলো শনাক্ত করার জন্য Nan এবং Iav বাগ-এর মডেলগুলো AlphaFold264 ব্যবহার করে তৈরি করা হয়েছিল। ক্যালমডুলিন মডেলিং যথাক্রমে PDB অ্যাকসেশন 4JPZ56 এবং 1CFD65-এ থাকা Ca2+-বাইন্ডিং এবং Ca2+-ফ্রি মডেলগুলোর রিজিড-বডি ফিটের উপর ভিত্তি করে করা হয়েছিল। সঠিক স্টেরিওকেমিস্ট্রি এবং ভালো জ্যামিতি নিশ্চিত করার জন্য মডেলগুলোকে স্ফেরিকাল রিফাইমেন্ট ব্যবহার করে পরিমার্জন করা হয়েছিল। এরপর ফসফ্যাটিডাইলকোলিন, ফসফ্যাটিডাইলইথানলঅ্যামিন এবং ফসফ্যাটিডাইলসেরিনকে সুনির্দিষ্ট লিপিড ডেনসিটি হিসেবে মডেল করা হয়েছিল, এবং NAM ও AP লিগ্যান্ডগুলোকে টাইট জাংশনের সংশ্লিষ্ট ডেনসিটিগুলোতে স্থাপন করা হয়েছিল। PHENIX66-এর eLBOW ব্যবহার করে আইসোফর্মগুলোর SMILES স্ট্রিং থেকে কনস্ট্রেইন্ট ফাইল তৈরি করা হয়েছিল। অবশেষে, PHENIX-এ লোকাল গ্রিড সার্চ এবং সেকেন্ডারি স্ট্রাকচার কনস্ট্রেইন্টসহ গ্লোবাল মিনিমাইজেশন ব্যবহার করে রিয়েল স্পেসে মডেলগুলোকে পরিমার্জন করা হয়েছিল। মডেল পরিমার্জন এবং কাঠামোগত বিশ্লেষণের জন্য MolProbity সার্ভার ব্যবহার করা হয়েছিল, এবং PyMOL ও UCSF Chimera X ব্যবহার করে চিত্রাঙ্কন করা হয়েছিল। 67,68,69 HOLE সার্ভার ব্যবহার করে অ্যাপারচার বিশ্লেষণ করা হয়েছিল,70 এবং Consurf সার্ভার ব্যবহার করে সিকোয়েন্স কনজারভেশন ম্যাপিং করা হয়েছিল।71
ইগর প্রো ৬.২, এক্সেল অফিস ৩৬৫, এবং গ্রাফপ্যাড প্রিজম ৭.০ ব্যবহার করে পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। সমস্ত পরিমাণগত ডেটা গড় ± স্ট্যান্ডার্ড এরর (SEM) হিসাবে উপস্থাপন করা হয়েছে। দুটি গ্রুপের তুলনা করার জন্য স্টুডেন্ট'স টি-টেস্ট (টু-টেইলড, আনপেয়ারড) ব্যবহার করা হয়েছিল। একাধিক গ্রুপের তুলনা করার জন্য ওয়ান-ওয়ে অ্যানালাইসিস অফ ভ্যারিয়েন্স (ANOVA) এবং এর পরে ডানেট'স পোস্ট হক টেস্ট ব্যবহার করা হয়েছিল। *P< ০.০৫, **পি< ০.০১, এবং ***পিডেটা বিন্যাসের উপর নির্ভর করে < 0.001 পরিসংখ্যানগতভাবে তাৎপর্যপূর্ণ বলে বিবেচিত হয়েছিল। GraphPad Prism 10 ব্যবহার করে Kd, Ki মান এবং তাদের অপ্রতিসম ৯৫% কনফিডেন্স ইন্টারভাল গণনা করা হয়েছিল।
গবেষণা পদ্ধতি সম্পর্কে আরও বিস্তারিত জানতে, অনুগ্রহ করে এই নিবন্ধে সংযুক্ত নেচার পোর্টফোলিও রিপোর্ট সামারিটি দেখুন।
প্রাথমিক মডেলটি PDB 4JPZ এবং 1CFD ডেটাবেস থেকে প্রাপ্ত ক্যালমডুলিন মডেল ব্যবহার করে তৈরি করা হয়েছিল। স্থানাঙ্কগুলি প্রোটিন ডেটা ব্যাঙ্কে (PDB) নিম্নলিখিত অ্যাকসেশন নম্বরগুলির অধীনে জমা দেওয়া হয়েছে: 9NVN (লিগ্যান্ড ছাড়া Nan-Iav-CaM), 9NVO (নিকোটিনামাইডের সাথে আবদ্ধ Nan-Iav-CaM), 9NVP (নিকোটিনামাইড এবং EDTA-এর সাথে আবদ্ধ Nan-Iav-CaM), 9NVQ (অ্যাফেনিডোলপাইরোলিন এবং ক্যালসিয়ামের সাথে আবদ্ধ Nan-Iav-CaM), 9NVR (অ্যাফেনিডোলপাইরোলিন এবং EDTA-এর সাথে আবদ্ধ Nan-Iav-CaM), এবং 9NVS (অ্যাফেনিডোলপাইরোলিনের সাথে আবদ্ধ Nan পেন্টামার)। সংশ্লিষ্ট ক্রায়ো-ইলেকট্রন মাইক্রোস্কোপি চিত্রগুলি ইলেকট্রন মাইক্রোস্কোপি ডেটাবেস (EMDB)-এ নিম্নলিখিত অ্যাকসেশন নম্বরগুলির অধীনে জমা করা হয়েছে: EMD-49844 (লিগ্যান্ড ছাড়া Nan-Iav-CaM), EMD-49845 (নিকোটিনামাইডের সাথে Nan-Iav-CaM কমপ্লেক্স), EMD-49846 (নিকোটিনামাইড এবং EDTA-এর সাথে Nan-Iav-CaM কমপ্লেক্স), EMD-49847 (অ্যাফিডোপাইরোলিন এবং ক্যালসিয়ামের সাথে Nan-Iav-CaM কমপ্লেক্স), EMD-49848 (অ্যাফিডোপাইরোলিন এবং EDTA-এর সাথে Nan-Iav-CaM কমপ্লেক্স), এবং EMD-49849 (অ্যাফিডোপাইরোলিনের সাথে Nan পেন্টামার কমপ্লেক্স)। কার্যকরী বিশ্লেষণের জন্য কাঁচা ডেটা এই গবেষণাপত্রে উপস্থাপন করা হয়েছে।
পোস্ট করার সময়: ২৮-জানুয়ারি-২০২৬
